比較 in vivoで研究アフリカツメガエル</em

サマリー

カエルアフリカツメガエル抗原特異的CD8 T細胞応答を促進するようなgp96などの熱ショック蛋白質の能力を探索するための魅力的な代替の非哺乳類モデルを提供します。私たちは、勉強する方法を提示 in vivoで促進。

要約

私たちは、両生類のアフリカツメガエルが chaperoned抗原のクロスプレゼンテーションを容易にし、自然免疫と獲得T細胞応答を誘発するようなgp96などの特定の熱ショックタンパク質（hsps）の能力を研究するために独自の非哺乳類モデルをアフリカツメガエル 。 ツメガエルの皮膚移植片の拒絶反応で開発している古典的MHCクラスIa（クラスⅠa）拘束性T細胞応答を惹起するgp96の能力を研究するための優れたプラットフォームを提供します。さらに、 アフリカツメガエルのモデルシステムはまた、それによって免疫監視を逃れるそれらのクラスIa分子をダウンレギュレートしている腫瘍に対して応答を生成するgp96の能力を探索するためのマウスに魅力的な代替手段を提供します。最近、我々は、抗原提示細胞（APC）として腹膜白血球を使用したアフリカツメガエルのクローンの養子セル転送アッセイを開発し、gp96が素数CD8 T細胞応答は、マイナー組織適合皮膚抗原に対するin vivoでだけでなく、 アフリカツメガエル胸腺の腫瘍15に対してできることが示されているクラスIa分子を発現していない/ 0。ここでは、腹膜白血球の誘発、パルスと養子移入だけでなく、皮膚移植と腫瘍移植アッセイを含むこれらのアッセイを行うために関係する方法論を説明します。さらに我々はまた、皮膚の拒絶反応と抗腫瘍応答に関与するエフェクター集団のさらなる特徴付けを可能にするフローサイトメトリーおよび増殖アッセイのために使用される末梢血白血球の収穫と分離して記述されています。

プロトコル

1。動物

X. laevisの X X.ジリハイブリッドLG - 6とLG - 15 isogeneticクローン^1は、ロチェスター大学（http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm）で私たちの繁殖コロニーからです。 LG - 6とLG - 15株と同じヘテロ接合体MHCハプロタイプ（/ C）が、マイナー組織適合性（H）遺伝子座で異なります。これらのクローンからの子孫は、女性によって生成さ二倍体の卵は、UV照射精子（子孫にはDNAの貢献）によって活性化される、雌性発生によって生産されています。

手袋の使用は、通性です。一部の人々は、それがカエルを処理するより困難な（滑り）と実際にはカエルに不快感に表示されるので、それらを着用しないことを好む。

2。 15 / 0腫瘍（腫瘍およびH - AGSマイナーの両方を発現）からgp96の精製

Gp96精製は、以前は^2、3を記載されている。簡単に言えば、gp96は錯那-セファロースとDEAEクロマトグラフィーを50〜70％硫安分画により精製される。タンパク質の約20〜50μgのは、腫瘍組織の1mlあたり得ることができます。準備の純度は​​SDS - PAGEとスライバー染色によって決定されます。

3。マイナーH - AG -異種LG - 6カエルから腹膜白血球（PLS）の誘発と収穫

1. 25mLの一夜E.を拡大37 50 mLコニカルチューブの大腸菌培養°振とうC。
2. 次の日の熱は、1時間のためにそれを煮沸して細菌を殺す。
3. E.を殺した熱を遠心4で2000回転（1,500 g）を℃で15分間大腸菌
4. 上清を除去し、1 / ¹⁰のapbsでオリジナルの培養液量（2.5 mL）に細菌ペレットを再懸濁します。この時点で細菌培養を使用する準備ができていると24時間以内に使用しなければなりません。
5. 25ゲージ5月8日針を使用して、カエルあたりの加熱死菌製剤の腹腔内（ip）200（2インチカエルの場合）または300μLを（3インチカエルのための）注入。
6. 射出PLS 3日後、腹腔内洗浄によって回収されています。
7. PLの収穫前に、大人のカエルはtricaineのメタンスルホン酸の0.1％水溶液（TMS、MS - 222）に浸漬して麻酔するすべての動きが停止するまで（時間は大きさや年齢によって異なります）までの5分間重炭酸ナトリウムで緩衝。動物は、治療後10〜20分以内に目覚める。
8. 70％エタノールの量が少ないカエルの腹部を消毒する。
9. 5mLの（2インチカエルの場合）または無菌のapbs 18ゲージ1 ½針を用いて腹腔内に室温で予め温めておいた10 mLの（3インチカエルのための）注入。針を外し、ゆっくりと注入されたバッファは、体腔内の流体との平衡化を保証するため分間カエルをマッサージ。
10. きれいな50 mLコニカルチューブに針の背面から滴下される腹水を収集するための注射器なしで新しい18ゲージ1 ½針を使用してください。可能な限り初期の注入量をできるだけ多く取得することを確認してください。腹部の中央部に血管を避けるように注意してください。
11. それはそれは、そのケージに戻って置くことができる、その時点で目を覚ましになるまで一度PLSは、浅い水を容器にカエルを入れて収穫されます。

4。ナイーブのLg - 6受信者にLG - 6 PLSのパルスとの養子移入

1. 風邪のapbsで一度PLSを洗って、4℃で10分間、1,000 rpmで（750 g）で、それらを遠心
2. 上清を取り除くとのapbsでPLSを懸濁します。
3. 5 × 10 ⁵ PLSあたり1μgのgp96の濃度でgp96とPLSをパルス。
4. gp96の適切な量がPLSに追加されると、1時間氷上でペッティングし、インキュベートしてそれらを混ぜる。
5. すべての非結合gp96を削除するには、4℃で10分間、1,000 rpmで℃で、1分間、14,000 rpmでどちらかの細胞を遠心分離します。
6. 残存gp96左がないことを確認するために冷たいのapbsと3X PLSを洗ってください。
7. 300μLあたり5 × 10 ⁵ PLSの濃度でパルスPLSを再懸濁します。
8. 養子25ゲージ5月8日針を用いて腹腔内注射でPLSを転送する。動物あたりのパルスPLS（5 × 10 ⁵細胞）を300μLを注入する。
9. カエルは、皮膚移植や腫瘍チャレンジ実験を続行する前に、少なくとも3日間プライミングする必要があります。

5。皮膚移植アッセイ

皮膚移植片の拒絶反応は、 アフリカツメガエル ^4、5、6の十分に確立されたアッセイである。 アフリカツメガエルでは、受信者は21〜22時18から22日以内に1または2のMHCハプロタイプの不一致を表示するドナーの皮膚℃を拒否対照的に、LG - 6とマイナーH - AGSだけが異なるLG - 15のクローンとの間の皮膚移植は、（より30日その）よりゆっくりと拒否されます。しかし、この拒絶はレシピエントのthaで加速されるtは前の皮膚移植によってまたはドナーから精製gp96での免疫化のいずれかによってドナーマイナーH - AGSに対して準備されています。まったく拒絶反応（例えば、クローン化または完全に近交系動物）ドナーとレシピエントが遺伝的に同一である場合に発生しません。したがって、この単純な技法は、gp96によって誘発される生体の免疫応答に特徴づけるための非常に強力です。

1. として3.7で説明ドナーのカエルを麻酔。
   注： アフリカツメガエルは、合計無菌処置の必要性がなくなります皮膚に強力な抗微生物ペプチド（例えば、マガイニン）生成するので、最低限の予防措置を取ることが必要。実際には、どんな消毒剤とカエルの治療は、肌に有害となる。さらに、 アフリカツメガエルは、人間に転送することができる任意の病原体を持っていない。そのため、手袋の使用はオプションです。しかし、使用されるすべての解剖器具はオートクレーブする必要があるとすべてのソリューションは、無菌である必要があります。
2. はさみを使用してLG - 15ドナーのカエルから腹側皮膚の小（20㎜× 5mm）を片（原因irridophore色素細胞の存在に銀色に表示される腹部の皮膚）をカットして取り外します。
3. ペトリ皿を含むのapbsで皮膚を配置し、その氷を見続ける。非常に穏やかに皮膚組織を操作し、鉗子の間でそれを保持していないように。
4. カミソリやハサミを使用すると、5ミリメートルにするX 5mmの部分を個々の移植をカット。氷の上のapbsにフラグメントしてください。
5. それは目覚めていると、それは抗生物質（5 mg / Lの濃度でPenstrep）を含む水中に置かれるまで、この時点で、ドナーのカエルは、浅い水でコンテナに配置されます。カエルは、それが通常の水に戻される時点で、二日間のための抗生物質で水に保持されます。皮膚が削除されたサイトで、小さな傷が縫い付けする必要があり、一週間以内に治癒していません。
6. 受信者のLG - 6カエルを麻酔。
7. 受信者の背側（背面）の皮膚に小さな切開を加えると、銀色の面を皮膚の下に5㎜× 5 mmの移植片を挿入する。これは変位あるいは移植片の損失につながる可能性があるため、皮膚の下に大きな気泡を導入しないように注意してください。
8. スコアリングが開始されると、それらが移植片拒絶反応としてカウントされていないため、移植上のはさみや鉗子のマーキングに注意して確認してください。
9. 24時間後にオーバーレイしてホストの皮膚の部分は移植片から除去する必要があります。
10. 受信者のLG - 6カエルを麻酔。 5.1で説明したように動物を扱う。
11. 移植片は自​​由に可視化できるようにオートクレーブはさみを使用すると、移植片の周囲に窓の外をカット。ドナーの皮膚に触れることや出血を誘発しないように注意してください。 5.5で説明したようにカエルが回復してみましょう。
12. スケッチを取ってすぐに移植を得点起動します。皮膚移植片の拒絶は、移植皮膚上irridophoresの破壊の割合によって決定されます。
13. 移植片は2〜3日ごとにチェックする必要がありますが、動物は、このための麻酔である必要はありません。移植を可視化するために、カエルは解剖顕微鏡下でペトリ皿に配置する必要があります。

6。移植皮膚のホールマウントの免疫組織

カエルホールマウント免疫組織学は、以前は次の^6を記載されている。簡単に言えば、カエル​​を麻酔し、カエルの水（作業領域も無菌的に調製される）とプリウェット滅菌ペーパータオルの上に顕微鏡の下に配置されます。移植皮膚は、その後、ホストの皮膚を周囲の少量と一緒に収穫され、それはフローサイトメトリー分析⁶の細胞の染色と同様に抗体で染色される。オートクレーブした楽器や滅菌緩衝液は使用する必要があります。皮膚を染色後、顕微鏡スライド上に配置され、静かにカバースリップを押す。この時点で、皮膚が移植片に侵入している別の細胞集団の蛍光顕微鏡を用いて可視化することができます。セクション5.5で説明したように手順の後、カエルは抗生物質で水の中に保持されます。と通常の水に戻った。皮膚が削除された場所、左の小さな傷は一週間以内に治癒する。

7。血白血球の特性評価

1. カエルから血液を除去する前に、人は炎を介して滅菌パスツールピペットを引いて、"ガラスの針を"準備する必要があります。ピペットの微細な先端は、実体顕微鏡下で研ぎ澄まされている。ピペットは、吸引のプラスチックチューブに接続されています。
   このような鉗子や鋏などのすべての楽器は使用前にオートクレーブ処理する必要があります。
2. またのapbsの1mLあたりヘパリン50単位を追加してのapbsとヘパリン溶液の氷冷10 mLを準備する。氷の上で解決してください。使用されるすべてのソリューションは、無菌である必要があります。
3. 3.7で説明したようにカエルを麻酔し、5.1で述べたのと同じ動物の取り扱い手順に従ってください。 。
4. 公開する後部足上記の皮膚をカット背側足根静脈。
5. のapbs +ヘパリン溶液の1〜2 mLでパスツールピペットを埋める。
6. 静脈に"ガラスの針"を挿入し、ゆっくりと口で吸引し血液の収集を開始します。これが凝固し、針の先端を目詰まりから血液を防止するので、それは"ガラスの針"でのapbs +ヘパリン溶液を持つことが重要です。
7. 血液1〜2 mLのは、1つの平均的サイズのカエルから得ることができる。
8. カエルの足の小さな切開は、縫い付けする必要はありませんし、傷は一週間以内に治癒する。
9. で10分間4℃で1,000 rpmで血液を遠心
10. 上清を除去し、コールドのapbsの10 mLの1X細胞を洗浄。
11. フィコールHistopaque 1.077（シグマ）赤血球から血白血球を分離するために、室温で予め温めておいた1mLの上に血のオーバーレイを2mL（1〜5 × 10 ⁶細胞）。
12. ブレーキなしで、室温で1,000 rpmで20分を遠心し、白血球バンドを収集する。
13. 4℃で10分間、1400 rpmで遠心分離でのapbsと2X細胞を洗浄° C残存フィコールを削除する。
14. この時点で、細胞はフローサイトメトリー分析用の抗体で染色される準備ができている、またはin vitroでの培養アッセイのために使用される。

8。腫瘍移植アッセイ

1. 15 / 0、腫瘍細胞の新鮮​​なバッチから実験の雪解けの前に約一週間と細胞がよく成長し始めることを確認してください。培地は、簡潔に次のセクションでは^、3で詳しく説明されています。
2. 15 / 0腫瘍細胞を展開します。
3. 実験当日に、細胞をカウントし、トリパンブルー排除により、細胞死を決定する。細胞死は5％未満でなければなりません。 4℃で1,000 rpmで寒いのapbsの1X細胞、及び遠心分離を洗う℃で10分間。
4. 300μLあたり5 × 10 ⁵ 15 / 0細胞の密度で腫瘍の培養培地で細胞を再懸濁します。
5. 動物の背側（背面）側の片側に25ゲージ5月8日針を用いて皮下注射することによりカエルあたり300μLボリュームで移植5 × 10 ⁵細胞。
6. 腫瘍の成長は、腫瘍チャレンジ後2〜3週間以内に開始されます。初期の腫瘍の外観を注意して腫瘍体積は、2〜3日ごとに記録する必要がありますする必要があります。腫瘍体積は、（高さX長さX幅）カリパスを用いて測定されます。
7. 腫瘍は3,500 mm ^3にして成長したり、カエルが無気力探し始めます、それは不快感を防ぐために安楽死する必要があります。いったん

9。試薬は必要なもの：

• 6.6グラム/ LのNaCl、1.15グラム/ LのNa ₂ HPO _4、0.2 g / LのKH ₂ PO：両生類のリン酸緩衝生理食塩水（のapbsを）バッファ。 10N NaOHおよびフィルタを用いてpH〜7.5は、0.2μmのフィルターを通して滅菌する。
• Tricaineメタンスルホネート（TMS、MS - 222）（クレセントリサーチケミカルズCAS＃886-86-2）。
• 重炭酸ナトリウム（Fisher Scientific社のS - 233 - 500）。
• Histopaque - 1077（シグマ - アルドリッチ10771から100 mL）を
• ヘパリンナトリウム塩（シグマアルドリッチH3149 - 50KU）
• アフリカツメガエル 15 / 0腫瘍のための培地[詳細については、3を参照してください]：10mLのインスリン、10 mLの非必須アミノ酸、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシンとイスコフDMEM基礎培地1 L（ギブコ-インビトロジェン11965）、10μgの/カナマイシン、primatone（シェフィールドの製品部門）、β2-メルカプトエタノールを1 mL、及び水に3.02グラムのNaHCO _3（pH7.0）を3mLの。この培地を30％再蒸留水を加えることによって両生類の浸透圧に希釈し、5％ウシ胎児血清、 アフリカツメガエルの腎臓の細胞株のA6から20％superantant、および通常のアフリカツメガエル血清の0.25％で補足される。

10。代表的な結果

図1皮膚の移植片の拒絶12日移植後のStereomicroscopic分析。 LG - 6クローン化されたカエルは、（A）MHC -同一のLG - 6（ない拒絶反応を示していない）または（B）MHC -本質的に異なる近交系ドナー（80％除去）から皮膚移植を受けた。矢印は、健康的（非拒絶）移植された組織をマーキング銀色の虹色素胞色素細胞を示しています。 （*）のマークは、拒絶反応によるものでは鉗子。

図2。 Gp96は、 アフリカツメガエルで腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを容易にします。LG - 15 PLSは、（5 × 10 ^5）のapbs（ネガティブコントロール）、E.から精製された組換えgp96の1μgのいずれかを氷上で1時間パルスしたgp96の大腸菌培養、または1または0.5μgのは、15 / 0の腫瘍組織から精製。 3回洗浄後、細胞を養子LG - 15大人の受信者（1 × 10 ⁶ /個）に移した。三日後、だった15 / 0腫瘍細胞（5 × 10 ^5）住んでいる皮下注射で移植する。各曲線は一カエルの腫瘍増殖の動態を表します。腫瘍が最初に現れた日後のチャレンジを監視し、腫瘍サイズはキャリパー（長さ×幅×厚）で定期的に決定した。

ディスカッション

両生類のアフリカツメガエルは、免疫を研究するユニークな多用途の非哺乳類モデルです。生物医学と免疫学的研究におけるその広範な使用は、このようなMHC定義されているクローンLG - 6とLG - 15だけでなく、さまざまな細胞株とモノクローナル抗体などの多くの重要な研究ツールで得られている。我々は強力なのAg特異的抗マイナーH - Agおよび抗腫瘍T細胞応答^7を仲介するようなgp96などの熱ショックタンパク質の能力を研究するためにin vitroおよび in vivoアッセイの別の確立されているこれらのツールを使用する。このモデルシステムでは、私たちはさらにプライミングとエフェクター細胞の各フェーズの期間、gp96免疫学的特性を調査することができます。

プライミング段階、そのような皮膚移植や腫瘍移植^2、8のようなin vivo試験の前に2週間間隔で10μgのgp96の2回の注射を必要とgp96を精製した皮下接種を使用するこれらの応答の初期の研究に関し。比較では、我々は

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<強い>必要試薬：
両生類用リン酸緩衝生理食塩水 (APBS):
NaCl, 1.15 g/L
Na2ハイパーパラメータ最適化4, 0.2 g/L
KH2PO
10N NaOH
トリカインメタンスルホン酸塩 (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
炭酸水素ナトリウム	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100ml
ヘパリンナトリウム塩	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Xenopus 15/0腫瘍用培地［詳細は3を参照］：
Iscove DMEM 基本培地	GIBCO (Life Technologies社製)	11965
インスリン
非必須アミノ酸
ペニシリン-ストレプトマイシン
カナマイシン
プリマトーン	シェフィールド製品部門
β2-メルカプト–エタノール
NaHCO3
30%二回蒸留水
5% ウシ胎児血清
アフリカツメガエル腎細胞株A6由来の上清20%
0.25%正常アフリカツメガエル血清
<強い>材料および器具：
50 mlおよび15 mlコニカル遠心チューブ（滅菌済み）
25ゲージ 5/8インチ Precision Glide 滅菌針	BD Biosciences
18ゲージ 1½ Precision Glide 滅菌済み針	BD Biosciences
1 ml 結核用スリップチップシリンジ（滅菌済み）	BD Biosciences
滅菌済み10 mlスリップチップシリンジ	BD Biosciences
1.5 ml マイクロ遠心チューブ（滅菌済み）
滅菌済みポリスチレン製ペトリ皿（60 x 15 mm）	Falcon BD
カミソリ刃
25 X 75 mm X 1 mm プレミアム顕微鏡スライドガラス	Fisher Scientific
10 cm ガラスシャーレ
9" Durex製 パスツールピペット ホウケイ酸ガラス製 綿栓付き 使い捨て	VWR international
Tygonチューブ
5番のスイス製精密ドライバー 2本’ピンセット	Miltex Inc.
マイクロ解剖用スプリングシザー McPherson-Vannas 直刃 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
Heliosノギス
解剖顕微鏡
高輝度照明装置
血球計数器
ブンゼンバーナーを取り除く
37°振盪インキュベーター
遠心分離機