In vitro膵臓神経可塑性アッセイ:健康および癌性のヒト膵臓組織抽出物に曝露された消化管ニューロンの変化の研究

要約

出典:Demir, I. E., et al.膵臓神経可塑性のシミュレーション:In vitroデュアルニューロン可塑性アッセイ。J. Vis. Exp. (2014年).

このビデオは、健康で癌性のヒト膵臓組織抽出物に曝露された後根神経節および筋腸神経叢ニューロンの形態学的変化を研究するためのin vitro神経可塑性アッセイを示しています。このアッセイにより、神経突起の成長、分岐パターン、およびニューロンのサイズを研究することができます。

プロトコル

1. ニューロンの分離

抽出物/上清の収集が終了したら、ニューロンの分離を続行します。

1. DRGニューロンの場合、斬首後出生後(P)2-12からDRGの立体顕微鏡解剖(図1A)までの間に、新生児ラットの頸部から腰椎へのDRGを収集します。24ウェルプレートに十分なDRGニューロンを持つためには、プレートごとに1匹の新生ラット(52DRGに相当)のすべての頸椎から腰椎のDRGを収集します。
2. マイクロハサミを使用して、DRGの末梢(神経)と中央の突起(根)を切り取ります。突起をそのままにしておくと、トリチュレーションが妨げられ、線維芽細胞による培養の汚染リスクが高まります。
3. MPニューロンの場合は、小腸から腸間膜を切り取り、小腸の脊髄層を手動かつ慎重に剥がします(MP分離の詳細なプロトコルについては、図1B)。MPについては、24ウェルプレートごとに2匹のラットから神経叢を採取します.
   手記：血清筋層の裂け目を避けるために、できるだけ穏やかになるようにしてください。
4. ゲンタマイシン(500ml培地に20mg)とメトロニダゾール(500ml培地に2.5mg)を供給された氷冷した最小必須培地(MEM)にDRGと血清筋層を収集します。.
5. DRGの収集後、コラゲナーゼIIタイプと一緒に供給されたHank's Balanced Salt Solution(HBSS)で20〜30分間インキュベートします。MP単離では、動物の年齢に応じて1〜3時間コラゲナーゼタイプでインキュベートします(図1C)。
6. MPの場合は、実体顕微鏡でネット状のMPピースを採取し、氷冷したMEMに移します。
7. 次に、直径が小さくなるシリンジでDRGとMPを粉砕します。
   手記：過度のトリチュレーションはニューロンを破壊する可能性がありますが、グリア細胞は破壊されません。
8. DRGまたはMPを含む培地が曇ったら、懸濁液を93.9 x gで5分間遠心分離し、培地を廃棄してNeurobasal培地(100 U / mlペニシリン、100μg / mlストレプトマイシン、0.5 mM L-グルタミン、2%B-27を補充)に再懸濁します。.
9. 細胞の総数(すなわち、ニューロンとグリア)を血球計算盤で数えます。
   手記： 必要なセルの数は、測定パラメータによって異なります。神経突起密度の定量化には、神経突起伸長、周辺核サイズ、および個々のニューロンの分岐パターンの測定よりも高密度の培養物が必要であり、したがってより多くの細胞が必要です。神経突起密度の測定には、例えば10,000細胞(ニューロン+グリア)/ウェルまたは1,500ニューロン/ウェルを使用します。個々のニューロンの形態計測には、細胞の短時間(1分間)トリプシン処理と、2,500細胞/ウェルまたは400ニューロン/ウェルの播種が推奨されます。1匹のラットから得られる細胞の典型的な収量は、約300,000〜500,000細胞です。
10. 前夜にコーティングした13 mmカバースリップに細胞を播種し、ウェルに神経基礎培地(100 U / mlペニシリン、100 μg / mlストレプトマイシン、0.5 mM L-グルタミン、2%B-27を補充)をウェルに播種します(図1D).
    手記：ポリ-D-リジン(40 mg / m²)またはオルニチンおよびラミニンコーティング(各1 mg / ml)コーティングされたカバースリップを使用してください。.細胞はpoly-D-lysineに非常に速く付着するため、多くの細胞が必要な実験(神経突起密度測定など)に適しています。ラミニンへの付着は一般的にやや弱いですが、ラミニンは神経突起伸長の強力な促進因子です。したがって、ニューロンの分岐と神経突起の長さの測定には、オルニチン/ラミニンコーティングを好みます。
11. 細胞をウェルに一晩付着させます。翌日、抽出物を添加した培地を調製します(最終抽出物/上清濃度100 μg/ml)。
12. 播種培地を吸引し、オプションでPBSで非常に穏やかに洗浄してから、抽出物/上清を補充した培地をゆっくりとピペットで移します(図1E)。
13. 細胞を48時間増殖させ、培地を吸引し、免疫染色のために4%パラホルムアルデヒドに固定します(図1F)。
14. ニューロン特異的(β III-チューブリンなど)およびグリア特異的(グリア線維性酸性タンパク質/GFAPなど)マーカーを使用して、二重免疫蛍光染色を行います(図1G)。
15. 形態計測には、CCDカメラを搭載した倒立型光学顕微鏡と、神経突起密度の測定を可能にする自動ソフトウェアを組み合わせて使用します(表を参照)。
16. ニューロン培養物の神経突起密度は、50 μm x 50 μmのグリッドを重ね合わせ、交差する繊維で測定された正方形あたりの繊維密度をカウントすることにより、各カバーガラス上の最も密集した成長の4つの異なる領域から200倍の倍率で4〜5枚の代表的な顕微鏡写真で測定されます。神経突起伸長、ニューロンあたりの平均枝数、平均枝長、および周辺核サイズは、神経突起と周辺核をマークすることにより、各カバースリップからランダムに選択された30の孤立ニューロンから測定できます(図1H)。

結果

図 1.in vitro神経可塑性アッセイの概略プロトコル。本アッセイは、新生児ラットの後根神経節(DRG)および筋腸神経叢(MP)ニューロンを利用して、膵臓組織抽出物または細胞上清がニューロンおよびグリア形態に与える影響を研究します。DRG は、前部椎弓切除術後に採取され、切除後に MP を含む血清筋層が採取され、小腸 (A、B) の機械的ストリッピングが行われます。コラゲナーゼII型消化後、ニューロンを必要な密度で播種し(詳細はテキストを参照)、24時間培養します(C、D)。次に、新たに調製した膵臓(または関心のある任意の消化器官から)抽出物および細胞上清を、ニューロンの成長培地に予め定義された濃度で添加する(E)。48時間後、培養物を4%パラホルムアルデヒドに固定し、ニューロンおよびグリアマーカー(F、G)に対して二重免疫染色します。神...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P1149
オルニチン/ラミニン	シグマ・アルドリッチ	P2533/L4544
13mmカバースリップ	メルク		24ウェルプレートで使用
ディスメンブラネーターS	ザルトリウス
抗β-III-チューブリン抗体	ミリポア	MAB1637	1:200 集中力
抗GFAP抗体	だこ	M0761	1:400の集中力
RIPAバッファー+プロテアーゼ阻害剤			任意のサプライヤー
神経基礎媒体	Gibco/ライフサイエンス	21103-049
B-27 サプリメント	Gibco/ライフサイエンス	17504044	B-27の品質はロット番号に依存することが知られています
ゲンタマイシン/メトロニダゾ			任意のサプライヤー
最小限のエッセンシャルメディア	Gibco/ライフサイエンス	31095から029
ハンクの平衡塩溶液(HBSS)	Gibco/ライフサイエンス	24020133	Ca/Mgを含有するとコラゲナーゼ活性が改善
コラゲナーゼII型	ワージントン生化学	CLS-2	少なくとも200 U/mgの活性を持つロットを取得する
トリプシン-EDTA 0.25%	Gibco/ライフサイエンス	25200056
4% パラホルムアルデヒド			任意のサプライヤー
AnalySIS ドキュメントソフトウェア	オリンポス

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