核輸送の1分子イメージング

サマリー

単一分子顕微鏡は、核輸送への新たな洞察を提供approch。

要約

単一分子蛍光顕微鏡のアプローチの有用性は過去10年間、生物学的反応を理解する上で非常に無駄であることが実証されています。細胞内の深い高時間空間分解能で分子間相互作用の調査は、ために個々の分子から生じる本質的に弱い信号に挑戦し続けている。 Yangらによる最近の作品。狭い視野落射蛍光顕微鏡、単一分子レベルでの核 - 細胞質間輸送の可視化を可能にすることを示した。信号に依存し、独立した貨物分子の単一分子のアプローチ、このような核輸送の時間と効率性などの重要な動力学、、によって得られている。ここでは0.4ミリ秒と12 nmの改良された時空間分解能を持つ方法論的アプローチのためのプロトコルを説明した。改良された解像度は、私たちは半無傷の細胞で核膜孔複合体（NPC）を通じて一時的な能動輸送と受動拡散のイベントをキャプチャすることができました。我々は、このメソッドは、他の結合と細胞内トラフィッキングのイベントを解明することに使用されることを期待しています。

プロトコル

1。単一分子の実験用セルのシステムの準備

1. 事前に少なくとも一週間は、37℃で融解し、5 mLのメディアで25cm ^2の培養フラスコに入れて在庫からのHeLa細胞株の新鮮な培養を開始し、37℃で細胞をインキュベート° C内で5％CO ₂ 24時間インキュベーターとは、細胞に最適な条件を提供するために少なくとも3回それを分割する。しかし、細胞は著しく減速する彼らの成長率の傾向のために20回以上に分割すべきではない。 HeLa細胞は、以前は遺伝的に核膜孔の膜タンパク質POM 121に融合したGFP（緑色蛍光タンパク質）を有するように設計された。それは、核膜の正確な局在に必要である。
2. 実験前日には、単一分子の実験を目的とした細胞を滅菌ペトリ皿に入れ、オートクレーブしたカバースリップ上に分散させる必要があります。カバースリップは4.5 g / Lのグルコースを添加したDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地、グランドアイランド、NY）、862 mg / Lのグルタミン- I、15 mg / mLのフェノールレッド、100 U / mlペニシリン、100μg/mLに懸濁しすべきストレプトマイシンおよび10％新生児ウシ血清。培養液量は一様にすべての面に分散、カバースリップあたり1mLのはずです。カバースリップを持つこれらのペトリ皿は、CO ₂インキュベーターに入れ、前の実験を24時間保持されます。単一分子の実験に適していることが細胞培養のための順....

ディスカッション

ケアは、実験中にNEと単一分子の適切な共存を保証するために注意する必要があります。信号が低い貧しいラベルまたは退色が原因である場合は特に、高い信号対雑音比を提供することも重要です。ローカライズの精度は、バックグラウンドノイズ（アウトフォーカス蛍光、CCDの読み出しノイズ、暗電流とその他の要因に起因する）によって制限されます。

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