我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス（3-6ヶ月齢）と成人cynomologusサル（9-15歳）を使用します。もともと博士リヒトマン（ガンの研究室で記述されたこの技術、ら。、2000）、、よく分岐樹状突起と樹状突起スパイン形態の研究に適していると従来の免疫染色と組み合わせることができます。
この記事について
サマリー
要約
DiOLISTIC染色は、脳スライスの神経細胞（。。オブライエンとラミス、2007;。ガンら 、2000ガンら 、2009）に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃を使用しています。ここではテクニックを設定するときに役立つのはいいと悪い結果の典型的な画像と一緒に必要な各ステップの詳細な説明を提供しています。我々の経験では、いくつかの手順はDiOLISTICSの成功したアプリケーションの重要な証明。これらの考慮事項は、DIIでコーティングされた弾丸の品質、固定剤曝露の程度、およびインキュベーションのソリューションで使用される界面活性剤の濃度が含まれています。一般的な問題に関するヒントと解決方法が提供されています。
これは、幅広い年齢層に複数の動物種に適用できる汎用ラベリング技術です。彼らは、蛍光遺伝子の発現に依存しているため、若い動物からの準備に制限、あるいはマウスに制限されている他の蛍光標識技術とは異なり、DiOLISTICの標識は、すべての年齢、種や遺伝子型の動物に適用することができますし、それと組み合わせて使用することができます細胞の特定の亜集団を識別するための免疫染色。ここでは、成体マウスと樹状突起分枝と樹状突起スパイン形態を定量化する目的を持つ成人の非ヒト霊長類の脳スライスの神経細胞をラベルするDiOLISTICSの使用方法を示しています。
プロトコル
1。 DII /タングステンビーズ箇条書きの準備 ：DII（1 - 1' -オクタデシル- 3、3,3'、3' - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）弾丸は脳のスライスを切るのを事前に準備する必要があります。手順は、一度に用意されているどのように多くの弾丸に応じて、約2〜4時間かかります。
- タングステンのビーズの新しいバッチから開始した場合、300mgをそれぞれのアリコートを準備。アリコートを、塩化メチレン2ml中にタングステンの6グラムを中断することによって調製される。 300mgのタングステンビーズのアリコートを生成するし、ピペット微量遠心チューブにビーズ溶液100μl室温で保管のアリコート（ 注 ：。塩化メチレンは非常にすぐに蒸発アルコールが蒸発を最小限に抑えるためにも使用できます ）。。。
- ビーズのアリコートから起動するとき、塩化メチレン、300μlの各アリコート（300mgのタングステンビーズを）再懸濁し、蒸発を防ぐために迅速にカバー。この量は、弾丸の3バッチには十分です。
- 親油性色素のDIIの13.5 mgを秤量し、塩化メチレンの450μlの（最終濃度=3mg/100μl）を追加することにより、色素溶液を準備します。
- 染料でコーティングビーズを。の部分にスライドガラスを置き、ワックスコーティングしたスライド上にビーズの紙とピペット100μlの重量を量る。ビーズは、薄い灰色を回すまではDIIの溶液100μlを追加、ピペットチップ、そして空気乾燥を使用してよく混ぜる。
- ガラススライドからビーズをこすりして微粉末にビーズをダイシングするためにカミソリの刃を使用してください（ 注 ： 染料を汚染しないように、弾丸の複数の色を行う場合は、新しい刃を使用 ）。。
- 15 mlコニカルチューブに紙と漏斗ビーズの重さにビーズをこすり落とす。水3 mlを加え室温で10〜30分間、水浴中で超音波処理（ 注 ： 粉体および超音波処理のダイシングは、個々の神経細胞の疎なラベリングを中断させコーティングされたビーズの塊の形成を最小限に抑えるために適用される）。。
2。ポリビニルピロリドン（PVP）ソリューションとチューブの準備：弾丸のチューブ（TEZFELのチューブ）にビーズの添付を改善するには、コートには、ポリビニルピロリドン（PVP）溶液で。
- 10mgのPVP / mlの濃度で水にPVP溶液10mlを準備します。
- もう一方の端を、それを追放して弾丸のチューブを通してPVP溶液を渡すためにチューブのアダプタ付き12mlの注射器（少し大きめの直径を持つフレキシブルチューブ）を使用して。いくつかのバッチが同時に準備されている場合のコートより多くの弾丸のチューブにソリューションを再利用。使用後はPVP溶液を捨てる。
- 弾丸のチューブにビーズを追加するには、ボルテックス均質な溶液を生成し、そのビーズが均一にチューブ全体に分散されるようにチューブを介してビーズ溶液を引くために注射器を使用するビーズ。 （（注：）チューブ内の気泡の数を最小限に抑えるようにしてください ）。
- 準備局を介してチューブを供給し、ビーズが沈殿することができます。唯一のビーズが残るように軽く水を除去するために注射器を使用してください。
- 水滴が表示されなくなるまで準備ステーションと窒素ガスと乾燥でチューブを回転させる。このステップでは、約10-20分かかります。
- DRIERITEまたは無水硫酸カルシウムのようなものを含むシンチレーションバイアルに13mmの長さと所定の位置にチューブカッターで弾丸を切る。光から保護するためにホイルでバイアルを包みます。
3。 DIIは、染色：この標識法は多様な種からの脳組織で神経細胞を染色するために使用することができ、この特定のケースでは、マウス（旧3月6日の月）とヒト以外の霊長類（9-15歳）から。
それは組織保存はこの状態で最良になることが予想されるので、スライスが固定溶液の経心臓的灌流によって得られる固定脳組織から調製することが好ましい。しかし、灌流による固定は必ずしも現実的ではない（のようなサルの組織の場合と同様）とDiOLISTICラベリングは、まだ正常組織の準備のためのさまざまな手続きの下で適用することができます。ここでは、組織の準備の3つの別の手順について説明します。
- 経心臓的灌流による脳を修正する→10分→カットのスライス用に脳→postfixを削除→染色
- 脳→組織のカットブロック→修正のブロック→PBS→カットスライスで洗浄→汚れを取り除く
- 脳→カットスライス→修正→洗浄→汚れを取り除く
本研究では、サルの脳をtranscardially氷冷の人工脳脊髄脳の収穫前に流体（ACSF）と尾状核を含む組織のブロック（厚さ4ミリメートル）で灌流した被験者から得られたND被殻は、室温で60分間固定した。すべての手順については、固定液は4％パラホルムアルデヒドとPBS（新鮮な準備または15日以内に使用される）の4％スクロースを含んでいます。固定時間は成功した染色ために重要であることに注意することが重要です。 Overfixationは原形質膜の完全性を破壊し（結果は下のより多くの情報を参照してください）細胞外に漏出する色素を引き起こすことによって染色に影響を与える可能性があります。
- 手順についてはa と b は 、スライス（200μmのは）固定された脳または組織ブロックとPBSで24ウェルプレートに配置されたスライスからカットされています。手順cには 、新鮮な急性脳スライス（200μm）を含有する冷加工溶液（mMで）110コリン- Clを、25のNaHCO 3、1.25ビブラトームで切断されているのNaH 2 PO 4、2.5のKCl、0.5 CaCl 2で 、7のMgCl 2は 、25グルコース、11.6アスコルビン酸、3.1ピルビン酸（浸透圧= 310 mOsmols）とすぐにスライスした後、24ウェルプレートに入れ、室温で固定液で30分間固定されています。
- PBSでのスライス、3回洗浄する。
- 撮影スライスする前に、井戸からPBSを除去して、ペイントブラシを使用して、ウェルの中央のスライスを配置します。
- サンプルとバレルの端の間に1.5cmの距離で銃を置くことによって120から180 psiのヘリウムガスの圧力でヘリオス遺伝子銃システムを使用して3.0μmの濾紙でDIIの弾丸を撃つ。
（ 重要な注意 ：これは、洗浄中にしてマウントするための面を上にスライスの同じ側を保つことが重要であるので、スライス面の50mm以内のみのニューロンは、このメソッドによってラベルが付けられますこの方法では、あなたがそのことを確認します。時共焦点顕微鏡とイメージング標識したニューロン）は焦点距離になります。 - PBSで3回のスライスを洗浄し、DIIは、樹状突起に沿って広がるようにするいくつかの時間のためにPBSに格納します。
- ゴールドの退色を延長するとスライドガラスの上にスライスをマウントし、18 × 18ミリメートル1号カバースリップでカバーしています。 （ 注：手順cに、それは、スライスの整合性がよく一晩維持されていないのと同じ日にスライスをマウントするのが最善です ）。
- メディアが乾燥した取付け後の明確なマニキュアとシール。
- また、スライスは、後述するようにマウントする前に抗体で染色することができます。
（ 注：4℃で暗所に保存されている場合スライドは、年間に少なくとも6ヶ月を使用することができます℃のDIIは敏感な光と光への長期暴露なのはフェードする汚れの原因となります ）。
4。抗体染色：免疫染色は、手順3.4の後に、取付の前に実行する必要があります。
- 透過性：0.01％でインキュベートスライストリトンX - 100室温で15分間、PBS溶液（ウェルあたり300〜500μL）であった。
注記：これは、DIIを溶解し、大幅に蛍光染色を低減するように界面活性剤の高濃度を使用しないでください。豊富なインキュベーションもDIIのラベリングを削減するように洗剤で時間を最小限に抑えるようにしてください。拡張インキュベーションが必要な場合は、ブロッキング溶液でPBSでスライスを保つのではなく。 - ブロッキング：室温で30分間PBSで10％ヤギ血清、0.01％トリトンX - 100を含むブロッキング溶液でインキュベートスライスを。
- 一次抗体：ブロッキング溶液（1:1000希釈で、例えばウサギ抗GFP抗体）の所望の希釈率で抗体を追加する。ウェルあたり300から500μlを加え、1〜2時間インキュベートする。 （ 注 ：一晩のインキュベーションが必要な場合は、ブロッキング溶液から界面活性剤を除去 ）。
- 5のためにPBSで切片を洗浄してください - 15分、3回。
- 二次抗体：室温で30分間二次抗体でインキュベートする。ブロッキング溶液で目的の希釈（1:1000希釈などのAlexa - ® 488コンジュゲート抗体）で二次抗体溶液を準備します。
- 5〜15分間、4回PBSで切片を洗浄してください。
- ゴールドの退色を延長し、18 × 18ミリメートル1号カバースリップでカバーしてスライド上のスライスをマウントします。マウントメディアが乾燥した後にマニキュアで密封する。
5。代表的な結果：
- 正しいラベルをチェック ：セクションは、水銀ランプと成功DiOLISTICラベルを確認するために赤色蛍光フィルターキューブを装備した蛍光解剖範囲下で可視化することができます。図1は、低倍率で得られた素敵なラベルが付いた脳切片の典型的な画像を示す。を探すために2つの重要な特性は、疎なラベリングパターン（図1A）と個々の細胞成分を（図1B - C）を識別する能力です。 トラブルシューティングDiOLISTICラベル ：図2は、DiOLISTICラベルが誤って働いているセクションの例を示します。我々の経験では、非効率的な標識のための3つの主な原因が考えられます。
- ラベルには、あまりにも希薄または密である ：非常に少数の細胞があるケースではセクションごとにラベルが付いていますかあまりにも多くの細胞が分離し、単一細胞内の要素の研究を防止ラベルが付いています。解決策：コーティングTEFZEL弾丸のチューブ（1.6節）に使用される最終的な解決策でコーティングされたビーズの濃度を調整する。それぞれ、あまりにも疎すぎたり密ラベルを補正するために、ビーズを溶解するために使用される水（3ml初期値）の音量を増減する。セクション上にコーティングされたビーズを撮影する場合に加えて、ラベリングの低効率は、最適なガス圧よりも小さいことが原因であると考えられます。この可能性はTEFZEL弾丸のチューブがコーティングされたビーズのほとんどをリリースしていると、それは撮影後に明確に表示されていることを確認することで除外することができる。そうでなければ、撮影のためのガス圧を大きくする必要があります。
- 悪い弾丸 ：染料でコーティングされたタングステンのビーズの大きな塊またはクラスタは、弾丸の準備中に形成される。のセクションでは、図2A - Bの例のようになります。解決策：セクション1.5と/に特に注意を払って新たな弾丸を作るか、またはセクション1.6で超音波処理時間を延長。
- オーバー固定 ：組織は、固定のための最適な必要な時間（200〜300μmのセクションのための30分、4 mmのセクションの1時間）より長くパラホルムアルデヒド溶液中に保持されます。これは、原形質膜の完全性が損なわれますし、細胞の外色素の分散による焦点外と思われるラベルに図2C - Dに示されているもののように見えるというラベルのセクションを生成します。解決策：固定時間を短縮。
- 共焦点イメージング：画像のスタックは、全細胞と樹状突起セグメントの63x水浸対物レンズ用20倍対物レンズと共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 510 META）を使用して取得されています。 DIIは、488 nmのレーザーラインを使用して、興奮した二次抗体からDPS 561 nmのレーザーラインと緑色の蛍光を用いて興奮していた。共焦点顕微鏡を使用するときに達成された試料の光学セクショニングはさらに、サンプル内の単一標識細胞の分離することができます。図3Aは、マウスの脳とその複雑な樹状突起の分岐パターンから線条体中型有棘ニューロンを示しています。げっ歯類（図3B）および非ヒト霊長類（図3C）からこれらのニューロンの樹状突起の枝の高倍率の画像は、両方の種にこの手法を用いて樹状突起と樹状突起棘の染色の程度を示す。長く、細い背骨中型有棘ニューロンのように豊富なヘッドを考慮しても樹状突起とその突起（スパイン）も、定義されて表示されます。
免疫染色でDiOLISTICSを組み合わせるときに、共焦点イメージングは、明確に同一の焦点面と同じセルに汚れをローカライズするにも便利です。図4は、単一のセルでGFPのラベリングと免疫染色DIIの共局在の例を示しています。画像は、D1ドーパミン受容体のプロモーター下に蛍光タンパク質GFPを発現するトランスジェニックマウスから線条体スライスから得られたつのスタック（0.7μmのZ -セクション）です。
図1。ヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞のDIIのラベリング。 （）DIIを持つ神経細胞の疎なラベリングを示していますカニクイザルから尾状核を含む染色した脳切片の低倍率画像。（BC）絶縁中型有棘ニューロンは、簡単に蛍光解剖スコープを使用して識別することができます。
図2。トラブルシューティングDiOLISTICラベリング。背側サルの線条体（）とマウス（B）染料でコーティングされたビーズの大きな塊を示し、結果として、何個々の細胞の要素を区別することはできませんから（AB）ステンドスライス。（CD）DiOLISTIC適用した結果を例示する画像時間や場所サル（C）およびマウス（D）組織に障害が発生した組織保存の長期間固定液に保管されたセクションへの標識。
図3。DIIで染色された線条体中型有棘ニューロンの共焦点画像。 （A）、細胞全体の画像のスタックは（BC）デンドライトセグメントは、マウスから。樹枝の形態学的解析を可能にする（B）およびサル（C）中型有棘ニューロンは樹状突起と棘の明確なラベルを見せる。
図4。免疫染色でDiOLISTICラベルの組み合わせ。 （A）DIIは、ラベルが付い（B）免疫染色は抗GFP抗体を用いた。 （2006年）。赤色と緑色蛍光のA.（C）コンポジット映像と同じフィールドには、GFP陽性ニューロンとしてDII標識ニューロンを識別します。
ディスカッション
DiOLISTICラベリングは、それが多様な種から、幅広い年齢層に、そして組織に組織切片に適用することができるため、蛍光標識する細胞のための、最も汎用性の高い技術の一つである（また、ガンらを参照して新鮮なまたはからの固定液で灌流動物を取得。、2009）。プロセスは、1〜2日かかるので、比較的高速であり、そのような免疫染色（Lee ら 、2006）など、他の多くの古典的なラベリングの手法と組み合わせることができます。これらは、親油性膜の整合性を構成すると色素が細胞外に漏出してしまうので、特別な注意は、固定およびインキュベーションのソリューションで高い界面活性剤濃度を使用するよりも避けるために注意を払う必要があります。抗体の浸透は、トリトンX - 100（Lee ら 、2006）、ならびにインキュベーション溶液中のジギトニンまたはサポニン（松林ら 、2008）の低濃度で促進することができる。この手法に適用できるいくつかの修正は、ガンら （2000）または抗体の曝露（ニーリーら 、2009）の長さと種類を変更することで説明され、複数の色素を持つ弾丸の使用を含む。
伝統的に、DIIは、脳内の神経突起をトレースするために使用されています。 DiOLISTICラベリングは、細胞の形態を調べるために有用な方法を記述することによって、そのアプリケーションを拡張します。神経形態は大きな関心のために脳と細胞の形状は、神経系の神経集団の機能の多様性に反映させるかもしれないという憶測に見られるような大きな多様性である。その一例としては、哺乳類の神経系のディスプレイの小さな突起の多くのニューロンはグルタミン酸作動性シナプスの部位である樹状突起と呼ばれるという事実です。この方法では、セル上にグルタミン酸作動性シナプスの密度は、本明細書に記載の標識法を用いて測定することができる樹状突起棘の密度、に相関させることができる。さらに、そのような樹状突起全体の長さ、分岐パターン、樹状突起棘の形状や密度などの他の形態学的パラメータが定量化し、研究することができる。
それは、より高い分解能共焦点イメージングを可能にするため、明視野顕微鏡（例えばゴルジ染色）に依存する従来の技法と比較すると、神経形態を研究するための蛍光標識の使用は、多くの利点があります。樹状突起棘の密度や形態を測定することを目的とした実験では、蛍光体としてDIIを使用してのもう一つの利点は、その親油性の特性です。 DIIは、細胞膜に分割し、神経突起と樹状突起の明確に定義された概要を提供します。ほとんどの樹状突起棘（1未満フェムトリットル）の少量を考えると、膜の染色は、より効率的であり、細胞質染色よりも小さく、細い突起のよりよい視覚化することができます。
開示事項
すべての動物の手順は、NIAAAとオレゴン国立霊長類研究センターの動物実験委員会からのガイダンスにしたがって行った。著者らは、開示することは何もない。
謝辞
我々は、彼らの共焦点顕微鏡にアクセスするためのテクニックと博士ふみ小野研究室の初期設定中にそれらの援助のためにマイケルフェデーとテレルホロウェイに感謝します。この研究は、NIAAAとNINDSの学内プログラムを通じて国立衛生研究所によって資金を供給された。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | |
| 塩化メチレン | Mallinckrodt Baker Inc. | H485-06 | |
| タングステンビーズ | Bio-Rad | 165-2269 | 直径 1.7 μm |
| ポリビニルピロリドン | Calbiochem | 529504 | |
| Tefzelブレットチューブ | Bio-Rad | 165-2441 | |
| チューブカッター | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | |
| Isopore膜フィルターペーパー | EMD Millipore | TSTP02500 | 孔径 3.0 μm |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| パラホルムアルデヒド | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
参考文献
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
- Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes. Methods. 30, 79-85 (2003).
- Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).
- Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).
- Neely, S. tanwood, Deutch, G. D., Y, A. Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry. J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).
- O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).
- Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats. J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).
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