方法論記事

マウスB細胞を精製における誘導とクラススイッチ組み換えの評価

DOI：

10.3791/2130

⸱

2010年8月13日

 , 
1Department of Immunology, University of Toronto

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

抗原曝露後、活性化B細胞の亜集団は、異なるエフェクター機能を有する抗体のアイソタイプを生成するためにクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているプロセスを経る。このレポートに記載されているプロトコルは、CSRを誘導して分析できる方法について説明します。 in vitroで B細胞機能を研究の目的のために。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体液性免疫はB細胞によって維持されると抗体の分泌を介して免疫系の分岐です。 B細胞の活性化により、免疫グロブリンの遺伝子座は、結合能と分泌される抗体のエフェクター機能を変更するために遺伝的改変のシリーズを受ける。このプロセスは、デフォルトのIgM抗体のアイソタイプがIgG抗体は、IgA、またはIgEのいずれかに置換されているクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているゲノムの組換え事象によって強調表示されます。それぞれのアイソタイプは、それによって免疫の維持にCSRが重要な意思異なるエフェクター機能を持っています。

免疫グロブリン遺伝子座の多様化は、酵素活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）によって媒介される。詳細にこのプロセスを説明する回路図ビデオがオンラインで入手可能（http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html）です。 AIDの活動とCSRの経路は、一般的にB細胞の機能とマウスにおける液性免疫の評価で検討されています。このレポートに記載されているプロトコルは、IgG3（他の抗体アイソタイプについては表1を参照）に切り替えるクラスを誘導する細菌のリポ多糖（LPS）をマウス脾臓とその後の刺激からのB細胞の単離の方法を提示。さらに、蛍光細胞染色色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）が刺激された細胞の細胞分裂、スイッチング1、2をアイソタイプに重要なプロセスを監視するために使用されます。

AIDとCSRが発生するメカニズムの規制はまだ明らかではないため、in vitroでのクラススイッチのアッセイで 、様々なマウスモデルでこれらのプロセスをテストするための信頼性の高い方法を提供する。これらのアッセイは、以前は次のノックアウトマウス3を用いて遺伝子の欠損のコンテキストで使用されている。さらに、B細胞のスイッチングのin vitroでのRNAノックダウンまたは導入遺伝子の発現4-6に遺伝子発現を調節するためにウイルスの伝達を付けることができます。実験のこれらのタイプからのデータは、AIDの活動、CSRの反応の解像度、およびマウスにおける抗体媒介性免疫の理解に影響を及ぼしている。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ステップI：磁気濃縮を経由して脾臓B細胞の分離を

  1. 実験用マウスは、免疫システムの完全な成熟を確保するために8〜12週間熟成されるべきである。
  2. 頚椎脱臼によりマウスを安楽死させると70％エタノールに浸漬。外科的腹部の左季肋部の皮膚と筋肉を通して切開を行うことによって脾臓を除去し、リン酸塩の3大部分にカット（PBS）緩衝生理食塩水。すべてのツールおよび試薬は無菌であることを確認してください。
  3. 1 mLのシリンジプランジャ、軽くマッシュPBSに70μmのセルストレーナーを介して脾臓のゴムの端を使用する。研削が大きい（増殖すなわち）細胞の破裂につながる可能性があるので押す動きではなく、研削モーションを使用してください。
  4. 5分間のこれ以上の350よりもgで細胞をスピンダウンし、PBSでペレットを再懸濁します。血球計数器を用いて再懸濁した細胞を数えます。
  5. キャップ付き滅菌5mLのポリスチレンチューブ（チューブあたり2 mLの最大音量）の5％正常ラット血清を含むPBSで1 × 10 8細胞/ mlの懸濁液を準備する。
  6. 細胞のあらゆるmLのためのEasySep負の選択マウスのB細胞の濃縮カクテルの50μLを追加。混合物をピペット、チューブにキャップをし、15分間冷蔵庫に入れてください。
  7. 細胞のあらゆる液を100μLEasySepビオチン選択カクテルを追加。混合物をピペット、チューブにキャップをし、....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上記で概説プロトコルは、プライマリマウスB細胞のクラススイッチの間にAIDの発現と機能を解析する標準的なアッセイを提供する。刺激のメディアへの変更は、他のアイソタイプ（表1 8、9に示す）に切り替える誘導できるものはありますが、このプロトコルでは、IgMからIgG3にするためにスイッチング誘導する細菌のLPSを使用しています。

我々がいることを指摘している、まだのような未知の理由のために、ウシ胎児血清はin vitroで観察されたスイッチングクラスのレベルに影響を与える可能性があります。それは、同一のロット番号は、実験的な一貫性を確保するために、すべてのCSRの実験に使用することが重要です。それはまた 、in vitroのスイッチング速度に最適な達成するためにウシ胎児血清ソースのパネルをスクリーニングするために有益であるかもしれません。マウス系統はまた 、in vitro 10 で見られるクラスの切り替えの度に影響を与える可能性があります。悪いようなSJLマウスのよう.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利害の衝突は宣言されません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は有用な議論のためのマーティンの研究室に感謝しています。この出版物は、保健研究のカナダ研究所（MOP - 89783）からの助成金によってサポートされています。 AMは、カナダのリサーチチェアティアII賞でサポートされています。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸緩衝生理食塩水GIBCO, by Life Technologies14190
EasySep マウスB細胞濃縮キットStem Cell Technologies19754
ポリスチレンチューブBD Biosciences352058
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA7030
CellTrace CFSE細胞増殖キットInvitrogenC34554
ウシ胎児血清（BCS）HycloneSH30072.03
RPMI 1640 培地GIBCO, by Life Technologies11875
Escherichia coli由来リポ多糖Sigma-AldrichL6529
β-メルカプト–エタノールGIBCO, by Life Technologies21985
ウシ胎児血清（FBS）HycloneSH30396.03
正常マウス血清Jackson ImmunoResearch011-000
精製ラット抗マウスCD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553141
ラット抗マウスIgG3BD Biosciences553401

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
  2. McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

BCFSELPSIgG3

関連記事