方法論記事

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

DOI：

10.3791/2151

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2010年10月15日

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY-University at Buffalo

この記事について

サマリー

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このプロトコルではのライブ解剖について説明ショウジョウバエ幼虫。

要約

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軸索輸送のメカニズムを解明することは、長距離輸送の欠陥は、異なる神経疾患をどのように影響するかを決定する上で非常に重要であることが示された。この本質的なプロセスの欠陥は、ニューロンの機能と発達に有害な影響を持つことができます。我々は、公開するように設計されている解剖のプロトコルを開発している

プロトコル

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1。試薬の調製

  1. 7.2フィルター滅菌するために、128 mMのNaCl、1mMのEGTA、4 mMのMgCl 2、2mMの塩化カリウム、5mMのHEPES、及び1000mLの、PHの36 mMスクロース：以下の化合物を追加することで、解剖のバッファの準備を準備します。

2。解剖のための準備

  1. Siligardキューブ：ゲルが約1インチ幅、1インチ長くし、高い約1cmにカットされています。ゲルキューブは、解剖時のガラススライド上に配置されます。キューブは、複数回使用することができます。
  2. ピン：解剖のために使用されるピンは、余分なショートにする必要があります。 minutienピンの鋭い底の部分は、解剖で最適に動作します。
  3. one鋭い顕微解剖の春のはさみが必要です。
  4. two細かい先端鉗子を必要とする。

3。幼虫のコレクション

  1. GFPタグ付き小胞のタンパク質を発現している第3齢幼虫を放浪する、ペトリ皿の上に収集されます。
  2. 幼虫は、すべての食物を取り除くために脱イオン水で洗浄されています。

4。幼虫のライブ解剖

  1. 幼虫は、スライドガラス上で解剖ゲルキューブに転送されます。幼虫は、解剖バッファーに浸漬する。
  2. 幼虫は、背側の上二つ細かいピンを使用して前部と後部でpinedている。
  3. 顕微解剖のはさみを使用して、小さなカットが後端近くに正中線で行われている。この切開からのカットは、前方に介して行われます。つのピンを使用して、側縁にカットキューティクルをピン。
  4. バッファの解剖のドロップを追加。ピンセットで慎重に腸、腸および脂肪体を除去。これらの組織のほとんどは、通常、背側切断時にしみ出す。
  5. 新鮮な解剖バッファーとバッファーを交換してください。幼虫は、乾燥させてはならないと常にバッファを解剖にする必要があります。
  6. 生体マーカーのMitoTrackerによりまたはLysoTracker で使用してインキュベーションを、解剖バッファ内の生体マーカーで希釈することにより、この時点で行われます。 生体マーカーでのインキュベーションでは、新鮮な解剖バッファを使用して解剖幼虫数回（5クイック洗浄）を洗浄した後。
  7. 最後の洗浄を交換した後syligardとすぐにカバーにピンを押し込みます。幼虫は、現在の観測の準備ができています。

5。解剖幼虫のライブイメージング

  1. 顕微鏡のステージ上にカバースリップとゲルを置き、倒立顕微鏡を使用してイメージ。
  2. 私たちは、幼虫の分節神経内小胞をタグ付きの画像に100倍レンズを使用してください。分節性神経が撮像される前に、腹側神経節の細胞体におけるGFPの発現が最初に評価されます。堅牢なGFP染色が腹側神経節に細胞体で観察されている場合、神経は、イメージングおよび評価に使用されます。
  3. CFP / YFPまたはRFP / YFPと分割ビューのソフトウェアのためのフィルタを使用してデュアルビューシステムを使用すると、我々は、同時に画像二人は生体内でタンパク質を標識できます。

6。代表的な結果

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図1：。幼虫の分節神経内に多くの軸索のトラックに多くの軸索小胞を示す代表的な画像は、軸索の蓄積を表す、GFPの塊を注意してください。

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図2：幼虫の分節神経内の多くの軸索小胞を持つ単一の軸索のトラックを示す代表的な画像。

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ディスカッション

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ショウジョウバエ幼虫の分節神経内シナプス小胞輸送のin vivoイメージングで軸索輸送のメカニズムを研究するための強力なツールです。我々は以前、反復配列の拡張は、小胞輸送3のダイナミクスにどのように影響するかを解明するために、拡張polyQリピートを発現している幼虫の神経内輸送のダイナミクスを評価するためにこのプロトコルを使用している。このプロトコルを使用して小胞の動きの速度はカイモグラフにビデオストリームを変換することによって決定することができます。遺伝学を用いて、GFPの小胞輸送は、GFPの発現を駆動するために特定のGAL4ドライバーを使用して、単一の軸索内、または複数の軸索内で可視化することができる。さらに、輸送のダイナミクスは、特定の遺伝子の変異を持つ幼虫に観察することができます。別のGFP変異体（CFPまたはRFP）でタグ付けさらに二小胞を同時に可視化することができる。

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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SGは、ニューヨーク州立大学バッファロー校からとJohn R. Oishei財団からの資金によってサポートされています。

MKはUBでCURCAによって学生研究賞によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マイクロ解剖用鋏 1本Fine Science Toolsスプリング鋏 – 刃 6mm、チップ径 0.125 mm
ピンセット 2本Fisher ScientificFisherbrand 解剖用マイクロアドソン ギザ付きチップピンセット
解剖用ピン 1箱Fine Science ToolsMinutienピン 直径 0.1mm

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
  3. Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).

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タグ

GFP

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