細胞（CFC）アッセイをコロニー形成は、造血前駆細胞が半固形培地でコロニーを形成しているのin vitroアッセイである。コロニー形態、細胞形態、およびフローサイトメトリーの組み合わせは、異なる造血系統に沿って増殖し、分化する前駆細胞の能力を評価するために使用されます。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト造血幹細胞/前駆細胞は、通常、骨髄、臍帯血、または末梢血から得られ、造血及び白血病を研究するために使用されています。彼らは、リンパ球と骨髄系の系統に分化する能力を持っている。コロニー形成細胞（CFC）アッセイは、半固形培地でコロニーを形成する能力によって造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを研究するために使用されます。入力セルの固定の数によって形成されたコロニーの数と形態は差別化する前駆細胞の能力についての予備的な情報を提供して増殖する。細胞はフローサイトメトリーとギムザ染色スライドの形態学的評価を使用して、その数字と分化の状態を評価するために、個々のコロニーからまたはプレート全体から収穫することができる。このアッセイでは、骨髄がリンパではない差別化を評価するのに便利です。この文脈における用語骨髄性は、単球、顆粒球、赤血球を包含する、その広い意味で使用され、巨核球系統れている。
我々は、末梢血由来の初代ヒトCD34 +細胞の分化に癌遺伝子の効果を評価するために、このアッセイを使用している。この目的のために細胞を対照レトロウイルス構築物またはこの場合NUP98 - HOXA9で、関心の癌遺伝子の発現コンストラクトのどちらかで形質導入されています。我々は、関心とGFPマーカーの遺伝子を生成するバイシストロンmRNAを発現し、一般的に使用されるレトロウイルスベクター、MSCV - IRES - GFPを、採用しています。細胞は、レトロウイルス形質導入の前に二日間のサイトカインの存在下で増殖させることによって事前にアクティブ化されます。さらに2日後に、GFP +細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって単離され、コロニーは表面に現れるまでの14日間一般的に、サイトカインを添加したとインキュベートメチルセルロースを含む半固形培地と混合。コロニーの数と形態は文書化されています。次いで、細胞をプレートから除去し洗浄し、カウント、およびフローサイトメトリーおよび形態学的検査に供される。造血過程で発現する細胞表面マーカーに特異的な抗体とフローサイトメトリーでは、系統と成熟段階についての情報を提供します。ライト - ギムザ染色後、顕微鏡下で個々の細胞の形態学的研究は、系統と成熟に関してさらなる情報を提供しています。癌遺伝子で形質ものに制御空のベクターで形質導入された細胞の比較では、造血系への分化に対する癌遺伝子の影響を明らかにする。
プロトコル
1。試薬の調製
- FMS -関連チロシンキナーゼ3（FLT - 3）配位子、マクロファージ/顆粒球コロニー刺激因子（GM - CSF）、幹細胞因子（SCF）、トロンボポエチン（TPO）、インターロイキン（IL）-3の滅菌1000Xストック溶液を準備する、およびIL - 6は、製造元の指示に従って。製造元の指示に従っても、無菌レトロネクチンのストック溶液（1mg/ml）を準備する。小分けにこれらのストック溶液を分割し、凍結融解を避けるために、-20℃に保つ。
- IMDMで2％FBSを準備します。
- 20％FBS、2mMグルタミン、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン（PS）の最終濃度で完全IMDM培地を準備する。使用直前に以下のサイトカインを追加します。100 ng / mlのFLT - 3リガンド、20 ng / mlのGM - CSF、100 ng / mlのSCF、100 ng / mlのTPO、50 ng / mlのIL - 3、および100 ng / mlのIL - 6。
- HBSSで1％BSA（フェノールレッドを含まないカルシウム＆マグネシウムフリー、）とD - PBS（カルシウム＆マグネシウムを含まない）で2％BSAを準備します。 4で0.22μmのシリンジフィルターや店舗を通過することによってソリューションを滅菌℃に
- 4℃HBSSと店舗で0.02％EDTAを準備℃に
- -80アリコートへの関心と....
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ディスカッション
CFCアッセイは、造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを決定し、癌遺伝子（4,5）の効果を研究するために広く使用されています。それは、コロニーは単一の前駆細胞の子孫を代表し、個別に、さらなる分析のために削除できるように、クローン検定というの液体培地より優れています。 CFCアッセイの制限は、より未熟な前駆細胞や造血幹細胞の検出のための適切ではないことがあるので、細胞は長期培養 - 開始細胞（LTC - IC）アッセイ（6,7）を用いて検出されています。実験では、AML関連の癌遺伝子NUP98 - HOXA9の骨髄および赤血球の成熟を阻害し、赤芽球過形成を（1、3）原因となることを示しているここで説明する。
メチルセルロースベースの文化が比較的長期であり、CFCの培地は抗生物質が含まれていないので、特に中および並べ替えの後に、細胞培養の汚染を防ぐために極めて重要である。わずかな細菌や真菌汚染は、文化を圧倒するでしょう。フローサイトメトリーおよび細胞形態の解釈には経験が必要です。トレーニングを受けた担当者と協議することをお勧めします。初代ヒト骨髄性前駆細胞と一緒に使用する適合性のために.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
我々は、フローサイトメトリー機器と並べ替えのサービスを提供する高速セルソーターのコアの使用のために、医学とセントルイス、ミズーリのバーンズユダヤ人病院のワシントン大学でアルヴィンJ ·サイトマンがんセンターに感謝します。この作品は、健康補助R01 HL082549とK02 HL084179（NRY）の国立研究所によってサポートされていました。サイトマンがんセンターは、NCIがんセンターサポート助成金P30 CA91842によって部分的にサポートされています。....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-グルタミン | Life Technologies | 25030 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3リガンド | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| レトロネクチン | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| トリパンブルー溶液 (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| ヒトメチルセルロース濃縮培地 | R&D Systems | HSC005 | |
| ライト/ギムザ染色液 | Harleco | 64571 | |
| リン酸緩衝液, pH 6.4 - Giordano処方 | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| メタノール | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| 正常マウス血清 | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| 抗ヒト CD11b フィコ–エリトリン結合抗体 | BD Biosciences | 555388 | |
| 抗ヒト CD33 アロフィコシアニン結合抗体 | BD Biosciences | 551378 | |
| 抗ヒト CD45 フィコ–エリトリン-Cy7結合抗体 | BD Biosciences | 557748 | |
| 抗ヒト CD71 フィコ–エリトリン結合抗体 | BD Biosciences | 555537 | |
| 抗ヒト CD235a アロフィコシアニン結合抗体 | BD Biosciences | 551336 | |
| 抗ヒト CD45 フィコ–エリトリン-Cy7結合抗体 | BD Biosciences | 557748 | |
| 24ウェル 未処理組織培養プレート | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm 未処理ディッシュ | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm 組織培養ディッシュ | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| グリッド付きスコアリングディッシュ | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml 遠心チューブ | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml 遠心チューブ | BD Biosciences | 35-2070 | |
| 3 ml シリンジ | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16ゲージ 鈍端 1½インチ針 | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics セルフィルター | Partec | 04-004-2327 | |
| 血球計数器 | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPXサンプルチャンバー | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus 顕微鏡スライドグラス（洗浄済） | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon フィルターカード | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon サイトスピン用スライドホルダー | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| キムワイプス | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm フィルターペーパー | VWR international | 28307-134 | |
| 倒立顕微鏡 | Nikon Instruments | Diaphot | |
| 顕微鏡カメラ | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| 顕微鏡 | Olympus Corporation | BX51 | |
| 顕微鏡カメラ | Olympus Corporation | DP71 | |
| スキャナー | Microtek | Scanmaker 4 | |
| ボルテックスミキサー | Fisher Scientific | 12-812 | |
| 組織培養インキュベーター | Sanyo | MCO-18AIC | |
| サイトスピン | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| 卓上遠心機 | Eppendorf | 5810-R | |
| 水精製システム | Barnstead | Nanopure-Diamond |
参考文献
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
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再版と許可
