マウスモデルにおけるシスターナマグナへのカニューレ移植

要約

出典: Xavier, ALR, et al.げっ歯類のマグナ槽へのカニューレ移植J. Vis. 経験。(2018年)

このビデオは、麻酔をかけたマウスの大槽にカニューレを埋め込む手順を示しています。この技術では、針に取り付けられたカニューレを硬膜を通して逆三角形の大槽に誘導し、脳脊髄液への標的を絞った送達のためにそれを固定します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 外科的処置
   注:慢性システルナマグナ(CM)カニューレ挿入により、動物は外科的処置から回復することができます。CM 注射はカニューレ移植の翌日に行われ、重要なことに、麻酔された動物または覚醒した動物のいずれかで行うことができます。これは回復手術であるため、手順は無菌条件下で行う必要があります。
   1. マウスの体重を量り(C57BL/6JRj、男女とも、8週間)、腹腔内(ip)注射によりケタミンとキシラジンの混合物(それぞれ100 mg / kg、10 mg / kg)で麻酔します。必要に応じて、外科的処置中にケタミンの半分の用量(50 mg / kg)をマウスに再投与します。あるいは、慢性カニューレ挿入の場合は、マウスを2.5〜3%イソフルラン、約1 L / min酸素(O₂)でイソフルラン誘導チャンバーに入れることにより、マウスを麻酔します。この場合、ノーズコーンを使用して、手術全体を通して1.5〜2%のイソフルラン麻酔を維持します。
   2. つま先のピンチ反射が停止し、呼吸がゆっくりと安定したら、動物を加熱パッドの上の定位固定フレームに入れます。
   3. 眼科用軟膏を塗ります。必要に応じて、手術中に繰り返します。
   4. マウスの頭と首を剃り、毛を取り除き、露出した皮膚を最初にアルコール綿棒で滅菌し、次にクロルヘキシジン(0.5%)またはヨウ素溶液(2%)で2回滅菌します。滅菌をさらに2回繰り返します。
      注:シェービング後に破片や髪の毛を取り除くために、外科用ドレープを変更してください。次に、無菌野を保護するために動物をドレープします。
   5. 慢性カニューレ挿入の場合は、切開部位に0.5〜1mlのリドカイン/ブピバカイン(それぞれ1mg/mlおよび0.25mg/ml)を皮下(皮下投与)します。術後鎮痛のためにブプレノルフィン(0.05 mg / kg; s.c.)を投与します。
   6. マウスを定位固定フレームに固定します。耳内または頬骨弓のいずれかで固定を確実にした後、頭をわずかに傾けて、体に対して120°の角度を形成します(図1E)。
   7. 首の筋肉のすぐ上に突き出ている頭蓋骨の部分、つまり後頭稜を見つけます。ピンセットを使用して上にある皮膚を持ち上げ、正中線に沿って約1cmのアーモンド型の皮膚片を切ります。綿棒またはアイスピアを使用して、結果として生じる出血を抑えます。
   8. 後頭稜を基準点として使用し、表層結合組織を引き離して下の首の筋肉を露出させます。
   鉗
   9. 子を切開部位の中央に前後軸で慎重に動かして、正中線の筋肉を分離します。両手に一対の湾曲した鉗子を持って、頭蓋骨の底近くの中央の先端を結合し、筋肉を脇に引き寄せます。
      注:これにより、半透明の硬膜の後ろで、上の小脳と下の髄質によって輪郭が描かれた小さな逆三角形として現れるCMが露出するはずです(図1Bおよび1C)。
   10. 外科用アイスピアまたは綿棒を使用して、CMを覆っている硬膜を拭きます。
2. CM
   人工
   1. 脳脊髄液 (aCSF) で満たされた注射器からカニューレを取り外し、30G 針をチューブの後端に取り付けたままにします。
   2. シリンジポンプに接続された蒸留水で満たされた100 μLシリンジに30G針を取り付けます。
   3. シリンジポンプを使用して空気を抜き、カニューレに約1cmの気泡を挿入します。
   4. シリンジポンプを使用して、12 μLの目的の脳脊髄液(CSF)トレーサーをカニューレに引き出します。
   5. CSFトレーサーで満たされたカニューレを、利き手に持った湾曲したピンセットでチューブで覆われた針の近くでつかみます。利き手ではない手の中指を反対側のイヤーバーに置き、後でカニューレの休憩として使用するために
   安定して保持します。
   6. カニューレをマウスヘッドに対して45°の角度で挿入し、硬膜を通して見える三角形の側面によって識別されるCMの中心に通します。小脳や髄質への浸透を避けてください。針が1〜2 mmの深さ、たとえばベベルが硬膜の下に完全に入っている点までのみ挿入されていることを確認してください。カニューレを保持しているピンセットを放し、カニューレを利き手ではない手に置きます。
      注:歯科用針の面取りされた端は、CMを覆う硬膜を突き刺すためにある程度の力を加える必要があります。
   7. 必要に応じて、手術用アイスピアまたは綿棒を使用して、浸透時にCSFの漏れを乾かします。
   8. カニューレを囲む硬膜膜にシアノアクリレート接着剤を2〜3滴塗布します。接着剤促進剤を一滴加えて、接着剤をすぐに硬化させます。頭蓋骨と針を歯科用セメント(約0.5 mg)とシアノアクリレート接着剤(3〜5滴)の混合物で覆います。直後に、接着剤促進剤を一滴塗布して硬化させます。

結果

図1:貯水槽マグナへのトレーサーの注入。)脳と頭蓋構造に対する大槽(CM)の位置を示すマウスの頭と脳の概略図。(B) 周囲の首の筋肉を鈍く解剖し、横に押し出した後の露出した CM の顕微鏡写真。(C)B(黒い長方形)に示されている領域のより高い倍率で、CM(破線)の逆三角形の構造と、周囲の構造、すなわち後頭稜、小脳、および髄質との関係に対するその位置を示しています。(D)<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SOPIRA carpule 30G 0.3 x 12 mm	Kulzer	AA001
クロルヘキシジン 0.5% (ジグルコン酸クロルヘキシジン)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
アルコール綿棒 70% イソプロピルアルコール 30 x 60 mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha Ophtha		145250
木製アプリケーター、二重綿棒 (Ø 約 4 - 5 mm、長さ約 12 mm)	ハインツ ヘレンツ	1032018
アイスピアーズ	メディコム	A18005
キムテック サイエンス 精密ワイプ ティッシュワイパー	キンバリー クラーク プロフェッショナル	5511
ロックタイト スーパーグルー 精密 5 g	ロックタイト		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Insta-Set CA アクセラレーター	Bob Smith Industries	BSI-152
歯科用セメント粉末	A-M Systems	525000
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 0.01 M; pH 7.4)	Sigma Aldrich	P3813
オボアルブミン、Alexa Fluor 647 コンジュゲート	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)溶液 (1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	62248
デキストラン、フルオレセイン、3000 MW、陰イオン性	Thermo Fisher Scientific	D3305
ケタミノール獣医 100 mg/mL (ケタミン)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20 mg/mL (キシラジン)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
キシロカイン 20 mg/mL(リドカイン)	アストラゼネカ	158543
マルカイン 2.5 mg/mL (ブピバカイン)	アストラゼネカ	123918
ブパック 獣医 0.3 mg/mL (ブプレノルフィン)	リヒター ファーマ AG	185159