移植モデリングのためのヒト脳オルガノイドへの蛍光神経前駆細胞の注入

要約

出典: Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation.J. Vis. 経験。(2023年)

このビデオでは、細胞とマトリックスの混合物を使用して、蛍光標識された神経前駆細胞(NPC)をヒト脳オルガノイドに注入する方法を示します。この方法は再現性があり、動物を含まないため、オルガノイドの破壊を最小限に抑えた移植が可能です。これは、神経移植と中枢神経系 (CNS) 疾患をモデル化するための貴重なプラットフォームを提供します。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所の IRB ガイドラインに従って実行されています。

1.脳オルガノイドへの標識細胞注射

注

:この論文では、製造元の指示に従って市販のキットを使用して脳オルガノイドを製造しました。これは、目的の脳オルガノイドに置き換えることができます。プロトコルのこの部分で使用される材料は、4°Cを超える温度での可溶化基底膜マトリックスのゲル化を避けるために予冷する必要があります。

可

1. 溶化基底膜マトリックスに接触するインスリンシリンジ、チップ、およびチューブを-20°Cで置いて冷却します。
実施
2. する注入回数に応じて、可溶化基底膜マトリックスの適切なサイズのアリコートを氷上で解凍します(~2 μL/注入)。所要時間は約30分です。
3. アリコートが解凍されている間に、細胞を分割し、収穫し、カウントします。
4. 注入ごとに必要な量を計算します。複数回の注射を行う場合は、細胞の総量を1.5 mLのチューブに入れ、最大1 mLのDMEM / F12.
   注:損失/ピペッティングエラーを説明するために、数回の追加注入を可能にする容量を使用する必要があります。
5. 次のステップの準備中に細胞を氷に入れます。
6. 解凍後、可溶化した基底膜マトリックスを氷冷のDMEM / F12で最終濃度3 mg / mLに希釈します。
7. 氷から単細胞懸濁液を取り出し、300 × gで4°Cで5分間回転させます。
   注:冷蔵遠心分離機が利用できない場合、室温での回転は一般に許容されるようです。
8. 細胞ペレットを乱すことなく、培地をそっと完全に除去します。希釈した可溶化基底膜マトリックス(3 mg / mL)に穏やかなピペッティングによって細胞ペレットを再懸濁し、実行する注射ごとに2 μLの最終容量を取得し、使用するまですぐに氷上に戻します。
   注:細胞の再懸濁は、気泡やゲル化の形成を避けるために、事前に冷却されたチップを使用してゆっくりと実行する必要があります。
9. 予冷したシリンジを-20°Cの冷凍庫からアイスバケツに移します。使用するまでそこに保管してください。
10. 脳オルガノイドの入ったプレートをインキュベーターから取り出します。ワイドボアの先端を使用して、注入するオルガノイドを35 mmの皿に移します。オルガノイドを安定させ、注射を容易にするために、オルガノイドを損傷することなく可能な限りすべての培地を除去します。
    注:オルガノイドの破壊を避けるために、広口径のチップを使用することが重要です。それらが利用できない場合は、滅菌ハサミで通常の P1,000 チップの端を切ります。
11. オルガノイドを含む35 mm皿を解剖顕微鏡の下に置いて、注射を誘導し、促進します。
    注:解剖顕微鏡が無菌領域で利用できない場合は、制御が多少低下していますが、解剖顕微鏡なしで注射を行うことは可能です。別の選択肢は、拡大ループまたはメガネを使用することです。
12. オルガノイドを注入する準備ができたら、冷却したP20ピペットチップで細胞を穏やかに再懸濁し、2 μL(注入する所望の数の細胞を含む)を事前に冷却した滅菌スライドガラス上に移動します。
    注:複数回の注入の場合、スライドガラス全体にさらに2 μLの容量を追加できます。氷の上に保管し、蒸発しないように注意してください。
13. 氷から事前に冷やしたインスリン注射器を取り出し、針の面取りを下に向けて2 μLの細胞懸濁液をゆっくりと引き上げ、すべての細胞/培地を取り上げます。
    注:空気が吸い込まれないように、非常にゆっくりと進めてください。
14. オルガノイドの入った皿の蓋を開け、顕微鏡で焦点を合わせます。片手で皿を持ちます。針のベベルを上に置き、もう一方の手で細胞をオルガノイド表面にゆっくりと注入します。
    注:組織の損傷を避けるために、ゆっくりと注入することが重要です。
15. 注射後、蓋を皿に戻し、注入したオルガノイドを1〜2分間放置します。
    注:これにより、希釈され、可溶化された基底膜マトリックスがゲル化し、細胞を所定の位置に保持します。培地の添加が早すぎると、表面にある細胞が洗い流される可能性があります。
16. 500 μLのオルガノイド培地をそっと加え、先端が広いオルガノイドを24ウェルプレートのウェルに移します。オルガノイドを37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートします。2日ごとに完全な培地交換を行います。
    注:画像調整に使用されるネガティブコントロールオルガノイド(模擬注射)を含めることが重要です。これを行うには、前述のように、希釈可溶化基底膜マトリックス(3 mg / mL)でオルガノイドを注入し、細胞なしで2 μLの最終容量を取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM F12/Glutamax	Thermo	10565018
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	356231	Phenol Red-free、LDEV-free