チオフラビンT蛍光を用いた細菌感染誘発性アミロイドの定量化

要約

出典: Balczon、R.、 et al。 緑膿菌による肺内皮細胞感染後の細胞傷害性アミロイドの検出法 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、アミロイドベータシート構造に結合する蛍光色素であるチオフラビンTを使用して、病原菌に感染した肺内皮細胞からの培養上清中のアミロイドを定量するプロトコルを示します。ベースラインと比較した蛍光の増加は、培養上清中にアミロイドが存在することを示しています。

プロトコル

1. 細胞毒性上清の分析

1. チオフラビンT(ThT)アッセイを行うには、ThT蛍光を使用して上清中のアミロイドを定量します。これらの測定には、フィルター滅菌された上清を使用してください。
   1. 8 mgのThTを10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁することにより、ThTのストック溶液(50倍)を調製します。混合後、0.22 μm フィルターで溶液をろ過し、微粒子を除去します。
   2. 測定のために、1 mL分光光度計キュベットで20 μLのThTストックを1 mLのPBSに加えます。希釈したサンプルを蛍光分光計に入れます。
   3. 425 nmの励起と450〜575 nmの蛍光発光を2 nm刻みでスキャンしてベースライン蛍光発光を測定します。
   4. 425 nmの励起と482 nmの発光を使用してタイムラプススキャンを実行し、60秒間0.2秒ごとにデータを取得します。
   5. タイムラプススキャンの最初の20秒は、ブランクキュベット内の蛍光を測定します。20秒で、スキャンを一時停止し、フィルター滅菌した上清10 μLをキュベットに加えます。キュベットを反転して混合し、蛍光分光計に戻します。
   6. 時間ベースのスキャンを再開し、最後の 40 秒のデータを取得します。
   7. タイムラプススキャンが完了したら、手順1.3で詳述したように、同じ設定を使用して最終的な蛍光発光スペクトルスキャンを実行します。

材料