細菌株間の競合的相互作用を研究するためのコインキュベーションアッセイ

要約

出典:Speare、L.、et al。Vibrio fischeri分離株間の競合的相互作用を定量化するための共同培養法J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオでは、細菌株が共有環境でどのように競合するかを研究するために使用される共インキュベーションアッセイを示します。微生物学では、これらの相互作用を促進する接触依存性または接触非依存性殺傷などのメカニズムを特定するために広く適用されています。

プロトコル

1. コインキュベーション株(図1B、C)
   1. 標識された1.5 mL遠心分離管に各株(OD 1.0に正規化)100 μLを加えて、参照株と競合株を1:1の比率(v / v)で混合します。コントロールとして、参照株をそれ自体の差動タグ付きバージョン(参照株pVSV102 + 基準株pVSV208)と混合します。この制御は、競合株の存在が参照株の成長に影響を与えるかどうかを判断するための後の統計分析に必要です。混合株培養を1〜2秒間渦巻きさせます。
      手記： 開始比率は結果に大きな影響を与える可能性があり、調整が必要な場合があるため、このステップでは最適化が必要な場合があります。
   2. 生物学的複製ごとにステップ1を繰り返します。このステップを完了すると、合計8つの混合株チューブがあるはずです:差動タグ付けされた参照株(対照)を持つ4つの生物学的複製、および差動タグ付けされた参照株と競合株を含む4つの生物学的複製(実験的)。
   3. 各対照混合物と実験混合物の10 μLをLBS寒天を含むペトリプレートにスポットします。これらの培養スポットは、インキュベーション後の蛍光顕微鏡検査に使用されます。
   4. すべての液体が寒天に吸収されるまで、スポットをベンチで完全に乾燥させ、ペトリプレートを24°Cで24時間インキュベートします。pVSV102およびpVSV208でタグ付けされた V.フィシェリ 株が、蛍光解剖顕微鏡を使用して、それぞれ集団レベルで緑色蛍光タンパク質(GFP)と赤色蛍光タンパク質(RFP)を視覚化するのに十分な細胞密度まで成長するには、最低15時間が必要です。ここでは、混合スポットをイメージングするために24時間のインキュベーションを使用します。
      手記： 湿りすぎたり、乾燥しすぎたりしないプレートを使用することが重要です。プレートが湿りすぎると、コインキュベーションスポットが寒天プレートに吸収されません。同じ日に注がれたプレートの使用は避けてください。プレートが乾燥しすぎると、寒天表面に小さな波や亀裂が形成され、共同孵化スポットの形状が不規則になることがあります。

結果

図1:コインキュベーションアッセイを示すフローチャート。(A)pVSV102(参照株は参照株またはR.S.)またはpVSV208(競合株はComp.株またはC.S.を示した)のいずれかを保有する細菌株は、参照株(LBS Kan)または競合株(LBS Cam)のいずれかに対して選択的培地で別々に増殖します。次に、菌株をLBSブロスに再懸濁し、OD = 1.0に正規化します。(B)参照株と競合株を体積比1:1で混合する。この混合物...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心チューブ	漁夫	05-408-129
10 μLマルチチャンネルピペット
100 μLマルチチャンネルピペット
300 μLマルチチャンネルピペット
10 μLシングルチャンネルピペット
20 μLシングルチャンネルピペット
200 μL シングルチャンネルピペット
1000 μLシングルチャンネルピペット
24ウェルプレート	漁夫	07-200-84	蓋付き滅菌
ペトリプレート	漁夫	FB0875713	蓋付き滅菌
TipOne 0.1-10 μL スターターシステム	USAサイエンティフィック	1111-3500	10ラック
TipOne 200 μL スターターシステム	USAサイエンティフィック	1111-500	10ラック
TipOne 1000 μLスターターシステム	USAサイエンティフィック	1111-2520	10ラック
LBSメディア
1M トリスバッファー (pH ~7.5)			50 mL 1 M ストックバッファー(62 mL HCl、938 mL DI 水、121 g Trizma Base)
寒天	テクニカルフィッシャー	DF0812-17-9	15g(プレートのみ追加)
脱イオン水			950ミリットル
塩化ナトリウム	漁夫	S640-3	20グラム
トリプトン	漁夫	BP97265	10グラム
酵母エキス	漁夫	BP9727-2	5グラム