原核生物培養液からプラスミドDNAの合理化精製

サマリー

このプロトコルは、より効率的な並列明確化し、プラスミドDNA精製のための費用対効果の高い代替手段です E.大腸菌文化。アクロアドバンスプロセスは、高い結合容量のDNA結合フィルタープレート上で精製して最適化されたライセートの清澄化フィルタープレートから始まります。

要約

我々は、原核生物の培養液から開始し、高純度のDNAで終わる、96プラスミド調製のためのアクロアドバンスフィルタープレートの完全なプロセスを説明します。細菌溶解物のクリアランスとDNA精製のためのマルチウェルろ過に基づいて、この方法では、プラスミド調製のための合理的なプロセスを作成します。シリカベースのメ​​ディアを含むフィルタープレートを簡単に真空ろ過やプラスミドDNAのかなりの量を得るために遠心分離で処理することができます。定量分析は、精製されたプラスミドDNAは、1.97の平均OD _280分の260の比率で高品質の一貫しているかを判断。全体的に、プラスミド収量は、シークエンシングやクローニングなどの下流のアプリケーションに、より純粋なDNAを提供する。アクロアドバンスフィルタープレートを使用してのこの合理化された方法は手動、半自動または全自動処理が可能になります。

プロトコル

1。ライセートクリアランス

1. E.を拡大37℃で一晩、適切な抗生物質とルリアブロスのディープウェルプレートにおける所望のプラスミドDNA（文化/ウェルを1mL）°振とう℃で形質転換した大腸菌の培養。
2. その後、10分間5000 × gでの培養プレートでペレット大腸菌 、上清をデカント。
3. 100μL再懸濁バッファー（50mMのTris - HCl、pH8.0の、10mMのEDTA、100μg/ mlのRNaseの）内の各ペレットを再懸濁する。
4. 100μL/ウェル溶解バッファー（200 mMのNaOHを、1％SDS）を加え、2分間プレートシェーカーを用いて振る。
5. 100 /ウェル中和バッファー（3.0 M酢酸カリウム、pH5.5）に追加し、2分間振とうする。
6. 説明プレートをライセートに細胞ライセートを転送する。
7. 真空マニホールドの底面に350μLコレクションプレートと場所の上にDNA結合プレートを置きます。 （図1を参照）真空マニホールドを組み立てます。
8. 真空装置の上にライセートの清澄化プレートを置きます。
9. 水銀10インチ（0.34 bar）で真空状態にしてDNA結合プレートにろ液を集める。水銀12インチよりも大きい真空を使用しないでください。 （0.41バール）。
10. 吸引マニホールドを分解します。装置の底部に2mLの廃棄物収集プレートを置きます。

2。 DNA結合

1. マニホールドの上にDNA結合プレートを移動する（図2を参照）。
2. 300μL/ウェル結合バッファー（6 Mグアニジン- HCl）を追加し、混在させると上下にピペッティング。
3. [遅い真空用水銀インチ〜5（0.17バール）]真空を適用し、ろ液を捨てる。 DNAが今膜に結合しています。
4. 洗浄緩衝液（80％エタノール）の400μL/ウェルで洗ってください。
5. 真空を適用し、ろ液を捨てる。 2 mlのコレクションプレートを使用したり、無駄に直接フィルタする場合、不要な捨てる。
6. 一度洗浄を繰り返します。
7. 乾燥して吸収性タオルにフィルタープレートの底にしみ。
8. 残留アルコールの除去を確実にするために5〜10分に一回以上の真空適用されます。
9. エタノール液滴の除去を確実にするために底部を覆い隠す。

3。 DNAの溶出

1. 70ウェル/μlの溶出バッファー（10mMトリス- HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）を追加します。高いDNA濃度が所望される場合、ボリュームは50μL/ウェルに低減することができるが、平均総収率が低くなります。
2. 1分間室温でインキュベートする。
3. 精製したDNAは、真空または遠心分離のいずれかで溶出させることができる。
4. 真空法：真空マニホールドに清潔なコレクションプレート（DNase処理、RNaseフリー）。すべての溶出緩衝液は、DNA結合プレートを通過するまで吸引マニホールドの上にフィルタープレートを置き、1分間はHg（0.5バール）15インチの真空を適用する。 （図3を参照）DNAを精製収集する。
5. 遠心法：5分間1,000 × gでクリーンなコレ​​クションプレートや遠心の上に配置浄化フィルタープレート。

4。定量的および定性的分析

1. OD _{280分の260を}測定し、DNAを精製したの濃度を計算する。
2. 精製PDNAのアガロースゲル分析を行います。

5。代表的な結果

大腸菌は、従来の遠心分離とポールアクロアドバンスライセートの清澄化フィルタープレートを使用して明らかにライセートを出発原料から破片のかなりの減少を示した。 （図4）。

3つの濃度でのプラスミドDNAをTEバッファーに添加し、アクロアドバンスライセートの清澄化フィルタープレートを通過させた。プラスミドDNA濃度の比較は、事前事後のろ過、ショーは3つのすべての濃度で100％の回収（図5）を見る。

明らかE.からのDNAの回収を実証するために、 大腸菌ライセート、プラスミドDNAは、粗溶解物に添加し、濾過によって清澄化した。同じプラスミドDNAは、ろ過後の細胞のライセートに添加した。電気泳動は、各サンプルからアリコート（図6）上で行った。各サンプルから同様の強度の単一の、明確なバンドは、ろ過ベースの明確化のステップの間に少しあればDNAの損失を示しています。

E.の文化PCATプラスミドDNAを含む大腸菌は、大腸菌から精製した大腸菌は、ポールの350μL及び1mLのDNA結合フィルタープレートだけでなく、350μLDNA結合プレートの二つのブランドを用いてライセート。メーカーの推奨するプロトコルで指定されたすべての精製を行った。最高DNA濃度と総収量は、ポールの1 mLのアクロプレップアドバンスDNA精製フィルタープレート（図7および表2）から見られている。

他社Wも高いDNA濃度を（155 ng /μLの）示していますが、全DNAの収量は、（4.7μgの/ウェル）低い回復量に起因する最も低いです、〜30μL。競合他社のMは、5.6μgの/ウェルの総収率で108 ng /μLのでDNAの最低濃度を与えた。

寒天つの異なるDNA結合プレートからPCAT DNAを精製したのOSEゲル分析は、図8に示されています。各収集されたサンプルの量は、電気泳動の前に回復量の差を補正するために65μLに調整した。すべてのサンプルは、スーパーコイルプラスミドDNAを示しているが、フィルタープレートの各々からのDNA収量が異なります。

図9に調製されたDNAはスーパーコイル構造を取ってすべてであると同様の濃度が表示されます。

図1。ライセート清澄化のための真空マニホールドの組み立て 。

図2。 DNA結合のための真空マニホールドの組み立て 。

図3。真空溶出用真空マニホールドの組み立て 。

図4。ろ過は、サンプルの説明を簡素化します 。吸引ろ過（350μLアクロプレップアドバンスライセートの清澄化フィルタープレート）または従来の遠心分離によって清澄化粗溶解物の300μLのトリプリケートサンプル。 OD _320は、明確化の前と後に測定。

図5。アクロアドバンスライセートの清澄化フィルタープレート通過後PDNAの完全回復 。 300μLのTEバッファーには25、50および100μg/ mLでPCATでスパイク。 DNA濃度と回収率は、N = 2の前とろ過後のOD ₂₆₀から計算。

図6。説明後のPCAT DNAの回収 。その後、明確化の前または後のライセートに添加pUC19の同量、TEバッファーで10に1を希釈した。 1.2％アガロースゲル上の2μL/レーンにロード。

図7。競合他社のプレートよりも飽きが来るアクロアドバンスDNA結合フィルタープレートでウェルあたりの高いプラスミドDNAの収量。1mLの（ポールと競合M）または1.5 mLで表示されたDNAの精製プレートを使用してPCATプラスミドDNAの収量（OD _260）（他社W）の一晩培養DH5α。板の製造業者の推奨するプロトコルを使用して精製。エラーバーは標準誤差（n個> 6）を示している。

図8。 PCATのDNAのアガロースゲル分析では、指示されたDNA結合プレートで精製 。精製PDNAの1.2％アガロースゲル電気泳動。 3つの別々の精製からプールされたサンプルは、溶出液は、精製、1:10に希釈した後、65μLに調整。レーンあたり2μLをロード。

図9。遠心または吸引方法は精製PDNAの最終的な溶出液を収集アガロースゲル電気泳動に使用されているときは同じような純粋なDNAの質と回復 。アクロプレップアドバンスフィルタープレートの製造業者の推奨するプロトコルは、PDNAの精製のために続いた。溶出は、2分間はHg（0.5バール）15インチで5分間または真空のために1,000 × gで遠心することにより行った。

ディスカッション

我々は、いくつかの利点に支払うアクロアドバンスフィルタープレートの安易な、合理化されたプロトコルを記述する。手動、半自動、また​​は完全に自動化されたアクロアドバンスの形式で処理したときにこのメソッドは、最大プラスミドDNAの収量が用意されています。ライセートクリアランスプレート上で統合されたプリフィルタは、偶数サンプル、微粒子のものを含む高いレベルの一貫性のあるろ過を提供します。より速く、より均一な最小限のホールドアップ量とプレート間の濾過速度のプレートの結果のほかジオメトリ、およびコンセントの先端の形状は、クロスコンタミネーションの心配なく、レシーバープレートへの試料の直接の流れを提供します。重要なのは、アクロアドバンスフィルタープレートのDNA結合プレートに高い結合容量膜は、高品質のプラスミドDNAの最大の回収用に最適化されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AcroPrep Advance フィルタープレート	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) または PN 8075 (350 µl)	清澄化用 3 μm ガラスファイバーおよび 0.2 μm Supor® メンブレン
AcroPrep Advance フィルタープレート	Pall Corporation	PN 8132	DNA結合用
真空マニホールド	Pall Corporation	PN 5017
真空ポンプ	Pall Corporation	PN 13157