プレーティングアッセイとフローサイトメトリーを使用した 大腸菌 における抗生物質誘発性フィラメンテーションの評価

要約

出典: Cayron、J.、およびLesterlin、C.ストレス処理下での細菌増殖のマルチスケール分析。 J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオでは、プレーティングによる生存率測定とフローサイトメトリーによる細胞サイズとDNA含有量の分析を使用して、細胞分裂阻害抗生物質処理下で 大腸菌 のフィラメント化とDNA複製を評価する手順を示します。

プロトコル

1. めっきアッセイ

手記： プレーティングアッセイは、培養サンプル中にコロニー形成単位(CFU)を生成できる細胞の濃度を測定します。この手順により、1つの細胞が2つの生細胞に分裂する速度が明らかになり、細胞分裂停止(例えば、細胞溶解の細菌生成時間の増加)の検出が可能になります。

1. 新鮮な培地で200 μLの培養サンプルのうち最大10^〜7 倍まで10倍に連続希釈します。非選択的ルリア-ベルタニ(LB)アガロースプレートに適切な希釈液100 μLをプレートし、37°Cで一晩インキュベートした後、3〜300コロニーを得る。注: 細菌の分裂を制限するために、新鮮な培地での連続希釈を迅速に実行する必要があります。あるいは、研究者は、希釈プロセス中の細胞分裂を防ぐために、炭素源のない生理食塩水を使用することを検討することもできます。
2. 翌日、コロニーの数を数えて、各培養サンプル中の生細胞の濃度(CFU/mL)を決定します。CFU/mLを未処理および処理した細胞培養の時間の関数としてプロットします。

2. フローサイトメトリー

手記： 次のセクションでは、フローサイトメトリー分析用の細胞サンプルの調製について説明します。この分析技術により、多数の細胞の細胞サイズとDNA含有量の分布が明らかになります。可能であれば、フローサイトメトリーサンプルをすぐに処理することをお勧めします。あるいは、サンプルを氷上に保持し(最大6時間)、プレーティングと顕微鏡イメージングが実行された後、一日の終わりに同時に分析することもできます。

1. 250 μLの培養サンプルを希釈して、4°Cの新鮮な培地で~15,000細胞/μL(OD_600nm ~0.06に相当)の濃度で250 μLを取得します。
   手記： 氷上でのインキュベーションは、細胞の成長と形態学的変化を制限します。あるいは、フローサイトメトリーで通常推奨されるように、75%エタノールで細胞を固定することを検討することもできます。
2. DNA染色の場合は、細菌サンプルをDNA蛍光色素の10 μg/mL溶液(比率1:1)と混合し、暗所で15分間インキュベートしてからサンプルを分析します。
3. サンプルを~120,000細胞/分の流速でフローサイトメーターに渡します。適切な設定で、前方散乱(FSC)光と側面散乱光(SSC)とDNA蛍光色素蛍光シグナル(FL-1)を取得します。
4. FSCおよびFL-1細胞密度ヒストグラムをプロットして、細胞集団における細胞サイズとDNA含有量の分布を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	バイオラッド	1613100	認定分子生物学アガロース
Attune NxT音響集束サイトメーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A24858	サイトメーター
hupA‐mCherry融合のための染色体挿入を担う大腸菌株			大 腸菌 MG1655におけるhupA-mCherryのP1形質導入によって作成
ルリアブロスアガロース培地	MPバイオメディカルズ	3002232	プレーティングアッセイ用増殖培地
SYTO9 緑色蛍光核酸染色	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S34854	DNA蛍光色素