微生物微小液滴培養システムを用いた細菌の適応進化

Abstract

出典: Jian、X.、 et al.、微生物微小液滴培養システム(MMC)を使用した自動微生物培養と適応進化。 J. Vis. 経験。 (2022)。

このビデオでは、微生物マイクロドロップレット培養システムを使用して、メタノール耐性に向けた細菌の適応進化を促進する方法を示します。改変された細菌培養物を高メタノールストレス培地と混合し、微小液滴に分割することにより、システムはメタノールストレス下で改善された成長を示す変異体を選択します。反復濃縮サイクルとコロニー単離を通じて、メタノールに適応した細菌株を培養し、さらなる分析または応用を行います。

Protocol

MMCにおける適応進化

1. 最初の細菌溶液の準備
   1. 関連する標準規制に従って、MeSV2.2用の特殊な液体媒体および固体プレートを調製し、121°Cで15分間オートクレーブします。
   2. 固体プレート(直径= 90 mm)を使用して、37°Cの恒温インキュベーターで72時間培養します。次に、独立したコロニーをピックアップし、10 mLの特殊な液体培地を含む50 mLのシェイクフラスコで、37°Cの振とうインキュベーター(200 rpm)で72時間培養します。
   3. 培養したMeSV2.2溶液を培地でOD₆₀₀ 0.1〜0.2に希釈し(総量が10 mL以上であることを確認します)、シェイクフラスコで5時間培養を続けて、最初の細菌溶液を取得します。
      手記： MeSV2.2は、メタノール必須大 腸菌 株です。特殊な液体培地には 500 mmol/L のメタノールが含まれており、これは MeSV2.2 にとって強いストレスであり、その結果、成長が非常に遅くなります。
2. MMC を初期化します。
3. 滅菌された試薬ボトルを 2 つ取り出し、そのうちの 1 つは最初の細菌溶液用で、もう 1 つは新鮮な培地用です。最初の細菌溶液(5 mL)、新鮮な培地(12〜15 mL)、およびMMCオイルを試薬ボトルに注入します。
   手記： 適応進化は複数の亜培養を伴う長期的なプロセスであるため、MMCにできるだけ多くの新鮮な培地を保存します。実験中は培地を補充できません。
4. 2本の試薬ボトルをMMCに取り付けます。1 つは C2 コネクタと O2 コネクタの間の初期バクテリア溶液用に、もう 1 つは C4 コネクタと O4 コネクタの間の新鮮な培地用に取り付けます。
5. ALEをクリックして、適応進化の機能を選択します (図1B)。 パラメータ設定インターフェイスで、OD検出スイッチをオンにします。

6. [数]を 50、[波長] を 600 nm、[濃度] を 0%、[タイプ] を [時間]、[パラメーター] を 30 時間、[繰り返し] を 99 に設定します。[開始] をクリックして、液滴の生成を開始します。所要時間は約25分です。
   手記： ここで「濃度」とは、適応進化のための化学的要因の最大濃度を指します。液滴が異なる場合、MMCでは、異なる濃度の化学因子を導入して、さまざまな成長条件を提供することが可能です。次の式を使用して導入濃度を計算します。

   

   ここで、「C」 は液滴に導入された化学因子の濃度を指します。「a」は、C4コネクタとO4コネクタの間の試薬ボトル内の化学因子の濃度を指します。「b」は、C6 コネクタと O6 コネクタの間の試薬ボトル内の化学因子の濃度を指します。「i」は利用可能な濃度を指します。MMCには8つの濃度があります。ここの化学因子は単一濃度(500mmol/Lメタノール)であり、培地の成分の一つであるため、ここには化学因子を含む試薬ボトルを1本だけ設置し、濃度を0%に設定する。タイプとは、サブ栽培のモードを指し、時間モード、OD値モード、蛍光モードの3つのタイプに分けられます。前者は、液滴を一定時間培養してから継代培養することを意味し、後者の2つは、液滴を事前に定義されたOD値/蛍光強度まで培養してから継代培養することを意味します。パラメータとは、サブ栽培モードを選択する際に必要な関連パラメータを指します。繰り返しとは、サブ栽培の数を指します。

7. C2コネクタとO2コネクタの間に置かれた試薬ボトルを取り外します。
8. 各亜培養期間中の液滴の最大OD値が大幅に増加しているかどうかを観察します。増加が発生し、実験要件を満たしている場合は、[データエクスポート]ボタンをクリックしてODデータをエクスポートします。
   注:ここで、亜培養期間はパラメータによって異なります。たとえば、[タイプ]を[時間]、[パラメータ]を[30時間]に設定すると、サブ栽培期間は30時間になります。各亜栽培期間中、液滴の最大OD値があります。適応進化が最大OD値の増加によって実験要件を満たしているかどうかを推定します(増加は、たとえば、20%以上増加した株の実際の栽培プロセスに依存します)。注意: 保管された新鮮な培地が使い果たされていないか注意してください。培地が使い果たされた後でも大幅な増加が起こらない場合は、よりよく成長している液滴を抽出し、新しい適応進化を実行します。
9. MMCからターゲット液滴を抽出します。
   1. [スクリーニング]ボタンをクリックして、液滴抽出の機能を選択します (図1C)。[収集]オプションを選択し、ターゲット液滴の数をクリックして、[OK]をクリックします。
      手記： 液滴スクリーニングには、「回収」「廃棄」「種子溶液の抽出」があります。「種子液抽出」とは、再培養作業後に残った液滴を採取することを意味します。
   2. ポップアップウィンドウが「CFクイックコネクタを引き出してEPチューブに入れてください」というプロンプトが表示されるのを待ちます。ソフトウェアのプロンプトに従って、CFクイックコネクタをマイクロ遠心チューブに入れて収集し、[OK]をクリックします(図2D)。
   3. 1〜2分後、ソフトウェアインターフェイスに「コネクタを元に戻し、完了したらOKをクリックしてください」という新しいウィンドウがポップアップ表示されます。次に、CFクイックコネクタを元に戻し、[OK]をクリックしてMMCの実行を続行します(図2D)。
      手記： すべてのターゲット液滴が収集された後、MMCは残りの液滴の培養を続けます。栽培が不要な場合は、停止をクリックして直接操作を終了します。
   4. 2.5μLのピペットで液滴を抽出し、90mmのアガロースプレートに落とし、一辺の長さ3cmの三角形のガラス散布棒で均一に広げます。その後、37°Cの恒温インキュベーターで72時間培養します。
   5. 3〜5個の独立したコロニーをピックし、37°Cの振とうインキュベーター(200 rpm)で48〜72時間、10 mLの新鮮な培地を含む50 mLのシェイクフラスコで個別に培養します。関連する標準規制に従って、培養細菌溶液をグリセロールチューブに保存し、その後の実験に使用してください。

Results

図1: MMCの操作ソフトウェアインターフェース。(A)ソフトウェアのメインインターフェイス。(1)手術室内の温度。(2)液滴認識の光電信号値。液滴が通過すると、信号値は高くなります(>2V)。オイルが通過すると、信号値は低くなります(<1V)。(3)機能の選択。選択できる機能は、成長曲線測定(成長曲線)、適応実験室進化(ALE)、単一因子マルチレベル分析(1因子)、実験ニーズに応じた操作のカスタマイズ(カスタマイズ)の4...

Materials