細菌細胞を用いたマイクロ流体プレートの準備

要約

出典: サトリーフ、A. L.、 他自動高スループットマイクロ流体システムを用いた 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa )のせん断応力のライブ細胞解析。 J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、細菌培養におけるせん断応力研究のためのマイクロ流体プレートの準備方法を示しています。チャネルに培地をプライムした後、細菌細胞を実験チャネルに導入し、インキュベーションして付着させます。残留培地と培養液は除去され、系を次のせん断応力実験に備えます。

プロトコル

1. メディア準備

1. 0.25%のグルコースを含む最小限の培地(MM)を準備します。0.25%グルコースを含むMM1リットルを作るには、滅菌M9塩溶液200 mL、無菌1 M硫酸マグネシウム(MgSO₄)2 mL、無菌1 M 塩化カルシウム(CaCl₂)100 μL、および最終体積1 Lの無菌20%(w/v)グルコース12.5 mLを水(dH₂O)に加えます。
2. 必要な培地を滅菌技術を用いて滅菌ボトルに移す。使用するチャンネル数に応じて必要な量を用意してください。通常、各チャネルはプライミングに200 μL、シーディングに300 μL、24時間実験に1300 μLを必要とします。
3. 実験温度に設定したインキュベーターや水浴槽に入れます。マイクロチャネル内で気泡が形成されないように、メディアは使用前に実験温度に保たれるべきです。

2. 強化緑色蛍光タンパク質(PA01-EGFP)を発現するPseudomonas aeruginosa株PA01の一晩・実験培養。

1. 無菌サイドアームフラスコに実験培地15mLを入れ、PA01-EGFPをストリークした寒天プレートから1つまたは2つのコロニーで接種します。培養液をインキュベーター/シェーカーテーブルで37°C、180〜220rpmで12〜16時間拡張します。
2. オーバーナイト培養の_OD600 を測定してください。OD₆₀₀ が0.80を超えた場合、新鮮なMMを使って一晩培養液を最終OD0.8に希釈します。実験培養液を37°Cのインキュベーターまたは水浴に入れ、マイクロ流体チャネルの播種が必要になるまで置きます。シード直前にOD₆₀₀ を再度確認し、目標OD₆₀₀(この場合は0.8)から大きく変わっていないか確認してください。

3. 機器の立ち上げ

1. ユーザーガイドに従ってシステムステーションをセットアップします。 図1のセットアップに似ています。機器とソフトウェアの接続でエラーを避けるために、以下の順序で機器をオンにしてください:
   PCワークステーション
   蛍光モジュール。蛍光シャッターがオンになっているか確認してください(シャッターボタンのそばの青色ランプが点灯しています)
   ハードウェアコントローラ
   イメージングシステムコントローラ( 材料表参照)
   CCDカメラ
   イメージングステーション(顕微鏡)
   注意:加熱されたプレートの温度は、所望の実験温度に調整する必要があります。
2. 制御適用を開始し、プレート側面のラベルにあるプレート番号を入力します。
   注:制御アプリケーションが起動した後は、顕微鏡/イメージングソフトウェアを制御するソフトウェア用と、ポンプとウェルプレートインターフェースを制御する制御モジュール用の2つのアプリケーションウィンドウが存在します。

4. マイクロ流体板のプライミングとシーディング

注:プライミング、シーディング、細菌の付着、成長は図2に示されています。

1. 48ウェルマイクロ流体板を包装から取り外し、底面のガラス面に触れないように注意してください。プレートの底のガラススライドはレンズティッシュ、綿毛のない布、または低綿毛の付いたワイプでしっかり拭き取ってください。
2. マイクロ流体チャネルのプライミングには、37°C MMの200μLピペットを出力井戸に注ぎ込み、気泡を避けて注意してください。プレートをプレートステージに入れ、界面をエタノールで拭き取って乾かし、その後プレートステージに密封します。
3. 制御モジュールの手動モードで、流体を次のように設定します。
   ルリア・ベルターニ(LB)は37°Cで、マックス・シアは5.00ダイネ/^cm2で測定されます。出力井をクリックして、出力から入力井戸への流れを起動し、チャネルをプライムします。5分間のプライミング後、シードの準備のためにフローを一時停止します。プレートをステージから慎重に取り外し、残留媒体を出力からピペット除去しますが、マイクロ流体チャネルへ通じる内側の円からメディアは取り除いてください。
4. 実験チャネルにシーディングするには、まず300μLのMMを入力ウェルにピペットし、その後300μLの細菌培養液を出力ウェルにピペットで送り込みます。プレートをプレートステージに戻し、プレートに置く前にインターフェースを拭き取るようにしてください。
5. コントロールモジュールでは、プレートステージを顕微鏡ステージに置いた後、ライブカメラ映像を使って単一チャンネルにフォーカスします。ライブフィードで視覚的にモニタリングしながら、約2〜4秒間1.00〜2.00ダイネ/^cm2 で流れを再開し、細胞が実験チャネルに入るようにしますが、蛇紋石チャネルには入らないようにします。細胞の付着を待つために、プレートを温度管理されたステージに1時間置いてください。1時間のインキュベーション中は、コントロールモジュールとモンタージュソフトウェアを自動運転に設定できます。
   注意:播種に必要な時間は培地や生物によって異なるため、最適化されるまでライブフィードで注意深く監視し、一般的な時間枠として使用してください。プレート全体のシーディングは異なる場合があり、完全なシーディングには特定のチャネル柱への流れの投入により多くの時間がかかります。
6. 取り付け期間が終わったら、プレートをステージから優しく取り外し、まず排出液から細菌をピペットで除去し、チャネルを乱さないようにしてください。新しいピペットチップで入力ウェルから培地を取り出します。

結果

図1:マイクロ流体システムの個々の構成要素。個々の構成要素は左から右へ順に並んでいます: 1.CCDカメラ、2台。自動ステージ、自動蛍光モジュール、オートフォーカスモジュールを備えた高分解能逆立顕微鏡、3.プレートステージ、4:イメージングシステムインターフェース、5:手動顕微鏡ステージ制御、6:蒸気トラップ、7:イメージングシステムコントローラ(温度コントローラーを含む)、8:ハードウェアコントローラ、9:蛍光コントローラ、10:無停電電源、11:画像保存用外付けハードドラ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化アンモニウム、ACS	VWR	BDH9208-500G	最小限のメディア構成の一部
BioFlux 1000 48ウェル低せん断プレート	フラクシオン・バイオサイエンス	910-0047
BioFlux 1000Z マイクロ流体イメージングシステム	フラクシオン・バイオサイエンス	BF 1000Z
塩化カルシウム二水化物、ACDグレード	VWR	97061-904	最小限のメディア構成の一部
デキストロース、無水、ACS	VWR	BDH9230-500G	最小限のメディア構成の一部
硫酸マグネシウムACSグレード	VWR	EM-MX0070-1	最小限のメディア構成の一部
リン酸カリウムモノベーシス、ACSグレード	VWR	BDH9268-500G	最小限のメディア構成の一部
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	本研究でGFP修飾を用いた緑膿菌菌株PA01。
塩化ナトリウム、ACS	VWR	BDH9286-500G	最小限のメディア構成の一部
リン酸ナトリウム、単塩基、無水、試薬級	VWR	97061-942	最小限のメディア構成の一部