方法論記事

ラットにおける急性心筋梗塞

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DOI：

10.3791/2464

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2011年2月16日

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1Department of Internal Medicine, Division of Cardiology, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston (UH), Texas Medical Center

この記事について

サマリー

急性心筋梗塞（AMI）のラットモデルでは、心臓の病態生理学的および生理学的機能に関するMIの結果を研究するのに便利です。

要約

米国（ハント）の死因をリードする心不全で、生物医学研究は、心血管疾患の治療を進めるための基本です。このような心不全と同様に（ゴールドマンとTarnavski）心肥大や心不全を誘発する圧力負荷（横大動脈狭窄）を、誘導心筋梗塞（MI）および虚血再灌流（IR）のような人間の心疾患を模倣する動物モデル、心血管疾患を研究するために有用なモデルがあります。特に、心筋虚血（MI）は、動脈硬化や外科的介入（Thygesen）を経由してのトリートメントなどを制御する特定のリスク要因にもかかわらず、心血管疾患の罹患率および死亡の主要原因である。さらに、心筋の急性損失は梗塞境界領域と、リモートの非梗塞心筋の心室リモデリングを誘導増加荷重条件下で心筋虚血（MI）の結果を以下。筋細胞アポトーシス、ネクローシス及び結果の増加血行動態負荷がLVの拡張、肥大、心室形状の歪み、およびコラーゲンの瘢痕形成を開始する複数の生化学的細胞内シグナル伝達を活性化する。この病理学的リモデリングと増加した壁を正規化するために障害が進行性の拡張、瘢痕にボーダーゾーン心筋の採用、および心筋の収縮機能（すなわち、心不全）で最終的には劣化の結果を強調している。ラットの左室機能不全と心不全の進行は、大規模な心筋梗塞を維持存続し、その後心不全（ゴールド）を開発して患者に観察されたものと似ています。ラットにおける急性心筋梗塞（AMI）モデルは、ヒトの心血管疾患を模倣するために使用されている;特に心不全の治療のための治療戦略の貢献度を評価するために心不全と同様に関連付けられている心臓のシグナル伝達機構を研究するために使用。このレポートに記載されている方法は、急性心筋梗塞（AMI）のラットモデルです。このモデルはまた、再灌流（IR）に続いて急性虚血性心筋症や虚血と呼ばれています。によって組織の再灌流に続いて左前下行枝（LAD）の結紮による虚血の急性、30分間によって誘導されるLADの結紮（Vasilyevとマコーネル）をリリース。変更することにより、心機能およびリモデリングの評価に向けて追加のコメント、このプロトコルは、再灌流の4時間以下のエバンスブルー色素、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）による梗塞サイズと領域アットリスク（AAR）の評価に焦点を当てる再灌流の持続時間は、また表示されます。全体的に、このAMIのラットの動物モデルは、心臓の病態生理学的および生理学的機能に関する心筋梗塞の結果を研究するために有用です。

プロトコル

1。営業エリアの準備

  1. 操作面は、最初に70％エタノールでエリアを消毒することによって調製される。
  2. すべての手術器具は、手術前にホットビーズ滅菌器（および個々のラットの手術との間で）で滅菌することがあります。これらの楽器が含まれます：外科はさみ（2）、ピンセット（1）、湾曲鉗子（1）、ニードルホルダー（2）、および胸のrectractorを。
  3. 綿のガーゼとアプリケーターが出血を管理するために利用できるようになります。
  4. ° C、体温の劇的な低下を防ぐために37℃で± 1の動物の体温を維持するために使用される恒温ブランケットシステム（加熱パッド）の温度を調整し、梗塞の大きさは、依存していますよく体温などの閉塞の持続期間（Tarnavski ら ）。
  5. 手術の前日、前の麻酔に、各動物はブプレノルフィン（0.1〜2.5 mg / kgのSQ）とカルプロフェン経口錠剤（1錠Rimadyl、Bioserv錠剤）の投与量を受け取ります。手術直前に一度、各動物は再びブプレノルフィン（0.1〜2.5 mg / kgをSQ）の投与量を受け取ります。
  6. 注：一定期間の心機能と心臓リモデリングの評価対象とした研究では（7 - 28日以降に）、ブプレノルフィン（0.1〜2.5 mg / kgをSQ）の用量を投与される、すべての6時間24〜48時間後に手術とカルプロフェン経口錠剤のための手術後に（"手術後の回復"を参照してください）​​1日1回提供されます。

2。ラットの作製と挿管

  1. 前の麻酔導入まで、動物は手術成績を複雑にする可能性のある既存の条件を識別するために検討され、身体検査は目視検査と心拍数、呼吸数、及び体温と体重の測定が含まれます。
  2. 動物が健康であると判断されれば、250〜300グラムの雄ラット（例えば、スプラーグドーリー）を検討する予定との識別特性が記録されます。
  3. ラットは、ペントバルビタール80 mg / kg体重で麻酔、麻酔の適切なレベルは、ラットの爪床の圧力（つま先ピンチ反射）と定期的手続きを通してを適用することにより、四肢の撤退の応答によって確認されます。
  4. ブプレノルフィン（0.1〜2.5 mg / kg体重; SQ）は手術時に投与される。
  5. 電気シェーバーは、毛皮のフォーム首と胸の部分を剃るのに使用されます。注：一定の期間（7 - 28日以降に）上の心機能と心臓リモデリングの評価を対象とした研究では、毛皮は完全に無菌状態を維持するために外科領域から離れて剃毛する必要があります。
  6. 剃毛の分野では、スクラブと70％アルコールでエリアを拭いて、続いbetadine液で消毒するか、このbetadineとアルコールのスクラブと消毒の手順が3回繰り返されることです。
  7. 麻酔動物は、体温を維持するために、恒温毛布のシステム上で仰臥位（加熱パッド）に配置されます。
  8. 気管内挿管は、それから気管の上に5 mmの半ばに首を切開し、筋肉組織の退縮することで、挿管の可視化を強化するためには、まず慎重に気管を露出することによって行われます。
  9. チューブが喉頭を介して入口を容易にするためにエッジに面取りされ、これは、気管内チューブ（PE 90ポリエチレンサイズ90）の挿入のためのよりよい視覚化することができます。
  10. 気管内チューブは、手術用実体顕微鏡を用いて支援可視化と、気管や気管内チューブの入り口を見ながら慎重に舌を操作することによって、気管に挿入されます。
  11. 機械換気は、ケント科学人工呼吸器（TOPOデュアルモード）80分あたりの呼吸と100グラムの体重当たり1.2 mlの一回換気量でのサイクリングに気管内チューブを接続することによって実現されます。
  12. 滅菌ドレープは、したがって、動作中に潜在的な汚染を最小限に抑え、露出だけ外科領域を残して、ラットの上に配置されている。
  13. 動物の外科医とアシスタントは、マスク、ガウン、手袋を着用すること。手袋は、個々のラットの手術の間で変更されていると。

3。一時的な左前下行（LAD）動脈結紮

  1. いったん安定した呼吸が確立されると、胸がスペースを開くには、止血やラウンド終了のはさみを使用して、左第四肋間スペースで開かれているが、組織を切断することなく、出血のリスクを低減することができる。
  2. 胸のリトラクタは、4番目の肋間スペース内に配置され、左心室（LV）が露出するようにリブを広めるために、肺を傷つけないように最大限の注意を取る。
  3. 心膜は、その後開いたが、可能であれば場所に残されている。
  4. 近左前下行（LAD）動脈は、の使用と、（図A - 1）識別されます。urgicalステレオ顕微鏡、およびLADは、一過的に30分間の虚血性周期（図A - 1）については6から0 proleneの縫合糸を使用して（またはスリップノットで接続することができます）ライゲーションが、心の具象化なしている。
  5. 心臓の再灌流を可能にするために、顕微はさみは、LADの結紮は、次の6から0 prolene縫合、30分で作られた合字（またはスリップノットを解放することによって）、に結び目を切断するために使用されます。
  6. シャム対照ラットでは、手順はLADが一時的に結紮されていない場合を除き、同一です。
  7. 流出は、肺の再膨張を可能にするために人工呼吸器でピンチオフ（1-2秒）簡単にしています。
  8. 胸のリトラクタが除去され、肋骨を結節縫合パターンを2から0 proleneの縫合糸を使用して一緒に描画されます。
  9. リブがクローズされると、人工呼吸器の流出は、適切な呼吸を確保するために、もう一度簡単に（1-2秒）ピンチオフです​​。
  10. 皮膚は連続縫合パターンを6から0 proleneの縫合糸を使用して閉じられます。

4。 LADの動脈の成功ライゲーションの確認

  1. LADの適切なライゲーションは縫合だけでなく、前壁の機能不全への遠位心筋組織の白化を観察することにより確認される;のような一時的LAD結紮の間に観察。
  2. 再灌流は心筋組織および前壁の運動のいくつかの回復のデモに赤い色のリターンによって検証されます。のような一時的なLAD結紮直後に観察。
  3. 注：一定期間の心機能と心臓リモデリングの評価対象とした研究では（7 - 28日以降にして）、心エコー図は、誘導の程度を決定するために、24時間後のLAD結紮を実行されます心筋梗塞。左室内径短縮率（LV FS）<20％、などの心エコー図から決定だけでなく、梗塞と一致して前壁の運動機能障害を持つすべての動物は、心機能およびリモデリングの研究をフォローアップのために特定され、使用されます。シャム対照ラットを40-45％の間で通常のLV FS（デルモンテらを）持つことが期待されています。

5。手術後の回復

  1. 手術が完了すると、動物の上に滅菌ドレープが削除されます。体温（直腸温度計による）、呼吸数（目視検査で）、心拍数（動悸によって）、そして痛みの異常な兆候は、動物が歩行可能になるまで監視する必要があります。
  2. ラットは、人工呼吸器から削除されますし、動物のケージに入れ、麻酔から回復するために許可される。このケージで、ケージの一端は、ラットが暖かさを追求できるように、加温パッドによって暖められます。また、水は、この観測期間中のラットに利用できるようになります。
  3. 脱水の兆候が手術後に観察されている場合、滅菌生理食塩水0.5mlを腹腔​​内（IP）に注射されます。
  4. ブプレノルフィン（0.1〜2.5 mg / kg体重; SQ）は、その後、手術直後、および手術後の回復中に投与されるであろう。
  5. 注：一定期間の心機能と心臓リモデリングの評価対象とした研究では（7 - 28日以降に）、ブプレノルフィン（0.1〜2.5 mg / kgをSQ）の用量を投与される、すべての6時間24〜48時間後に手術の手術後。カルプロフェン経口錠剤（Rimadyl、Bioservタブレット）も、少なくとも48時間後の手術のために（1錠毎日）提供されます。

6。虚血再灌流の組織学的評価

  1. 4時間の再灌流期間終了後、ラットをペントバルビタールとLADの80 mg / kgので再び麻酔される（Huangらとカイザーら）（またはスリップノットがretiedすることができます）再び連結されている。
  2. 1ミリリットルの5％エバンスブルーは（リン酸緩衝生理食塩水で）、右心室に注入し、2分間灌流することが許可されます。
  3. 2分後、飽和塩化カリウム溶液1mlは、拍動から心臓を停止させるために右心室に注入される。
  4. 心臓はその後、急速に、切り出したアガロースはリン酸緩衝生理食塩水2％に埋め込まれており、1〜2ミリメートルのスライスにして区画されている。
  5. 生存心筋は、キャプチャされた20分、各スライスの画像を2％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色される。画像は心筋の領域の量を識別するために定量化されています：（1）それはないアットリスク（ブルーセクション）、（2）エリア - アットリスク（AAR、赤と白のセクション）であり、及び（3梗塞された）領域（白"染色"の項）（図-2）。

7。代表的な結果

梗塞サイズと領域アットリスク（AAR）の評価を含む研究については、エバンスブルー色素、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で、再灌流の4時間以下、LADの適切なライゲーションを確認することができます。として一時的なLADを結紮中に観察された。縫合だけでなく、前壁の機能不全への遠位心筋組織の白化を観察すること。再灌流は心筋組織および前壁の運動のいくつかの回復のデモに赤い色のリターンによって検証することができる、一時的なLAD結紮直後に観察。 （ - 28〜 - 7日以降）、時間の期間にわたって心機能と心臓リモデリングの評価を含む研究の場合は、再灌流に続いて虚血の適切なライゲーションは、前壁の組織、機能不全のブランチングすることにより確認することができる再灌流は、次の壁運動のいくつかの回復と赤の色のとリターン。さらに、心臓機能障害が誘発される心筋梗塞の程度を決定するために、24時間後のLAD結紮を実行される心エコー図によって決定することができる。左室内径短縮率（LV FS）<20％、などの心エコー図から決定だけでなく、梗塞と一致して前壁の運動機能障害を持つすべての動物は、心機能およびリモデリングの研究をフォローアップのために特定され、使用されます。シャム対照ラットを40-45％の間で通常のLV FS（デルモンテ）を持つことが期待されています。

図1
図1。心筋梗塞とLADの結紮の模式図。 （1）心筋梗塞と疫病の形成によって引き起こされる心筋梗塞を模倣するために使用される縫合糸を用いて左心室の左前下（LAD）動脈、（2）ライゲーションの模式図。

図2
図2。AMIに続いてラット心臓の代表的なイメージ。代表的な青（非閉塞冠状動脈灌流領域）で領域を示すラットの心臓の画像、梗​​塞の領域アットリスク（AAR）を示す赤色（閉塞冠動脈灌流領域の面積、および黄色/白（梗塞ゾーンのエリアAAR以内）。

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ディスカッション

また、虚血再灌流（IR）と呼ばれるラットの急性心筋梗塞（AMI）は、、一般的に心不全につながる人間の心室リモデリングを模倣するために使用されます。動物モデル（ラット及びマウス）における左室機能不全および心不全の進行は、MIを維持存続し、その後心不全（ゴールド）を開発し、ヒトで観察されたのと似ています。このプロシージャは、このテクニックのあるバージョンを紹介し、また方法論的な変動を説明する追加の注意事項が含まれている。急性心筋梗塞（AMI）プロシージャへの追加のようなバリエーションが虚血の持続時間と再灌流の持続時間が含まれています。また、アクセス権を取得し、LADを連結するために使用される外科的処置についてのバリエーションがあります。 （; MI永久）慢性的に制限され、代わりに、または、虚血期間の長さに関しては、心筋梗塞を誘発するためにLAD結紮の時間は（AMI 60分〜30分）急性制限することができます。心筋梗塞の評価（すなわち、その後の再灌流の期間）にこの初期虚血期間に続く再灌流の持続時間に関しては、梗塞サイズと領域アットリスク（AARを評価するために、（4時間24時間まで）短くすることができます）エバンスブルー色素、トリフェニルテト...

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開示事項

利害の衝突は宣言されません。

謝辞

BKM国立衛生研究所（NIH）/国立心臓肺血液研究所（NHLBI）の助成金（R01 - HL085487）によってサポートされています。 MHは、米国心臓協会ナショナル（AHA）科学開発グラント（SDG）及び老年循環器学会でサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
人工呼吸器Kent ScientificTOPOTOPO Dual Mode
恒温循環装置 E103Harvard Apparatus732802
恒温ブランケットシステムHarvard Apparatus55-7222F
実体顕微鏡Nikon InstrumentsMMA36300SMZ-645 ズーム実体顕微鏡
ホットビード滅菌器Harvard Apparatus610183
電気シェーバーGE Healthcare
ブレードおよびハンドルWelch Allyn690047-1標準（ランプ）喉頭鏡ブレード
外科用剪刀Fine Science Tools14014-17
外科用剪刀Fine Science Tools14072-10
ピンセットFine Science Tools11028-15
曲がりピンセットFine Science Tools11001-12
持針器Fine Science Tools12004-18
持針器Fine Science Tools91201-13
胸部開創器Fine Science Tools17008-07
マスクVWR international47730-640
ガーゼスポンジDermacea441205
滅菌手袋Cardinal Health2D7203I
PE 90 チュービングBD Biosciences427420
20 ml シリンジBD Biosciences301625
6-0 Prolene 縫合糸Ethicon Inc.8706H
2-0 シルク縫合糸Ethicon Inc.K873H
ペントバルビタールナトリウム注射液OVATION PharmaceuticalsNDC 67386-501-55
ポビドンヨードNOVAPLUSV10-8204
ブプレノルフィンPharmaceuticals Inc.NDC 12496-0757-1

参考文献

  1. Hunt, S. A., Baker, D. W., Chin, M. H., Cinquegrani, M. P., Feldmanmd, A. M., Francis, G. S., Ganiats, T. G., Goldstein, S., Gregoratos, G., Jessup, M. L., Noble, R. J., Packer, M., Silver, M. A., Stevenson, L. W. SC.ACC/AHA Guidelines for the Evaluation and Management of Chronic Heart Failure in the Adult: Executive Summary A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee to Revise the 1995 Guidelines for the Evaluation and Management of Heart Failure). Circulation. 104, 2996-3007 (2001).
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