方法論記事

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

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DOI：

10.3791/2563

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2011年2月27日

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1UT Health Science Center at San Antonio, Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology

この記事について

サマリー

マウスの眼の解剖の正式なデモンストレーションは、網膜色素上皮の全マウントをもたらす。

要約

網膜色素上皮（RPE）はちょうど（ロッドとコーン）光受容体を含む神経網膜の下に、哺乳類の目の後ろに位置しています。 RPEは、密接にちょうどその上の神経網膜と色素立方細胞と関連付けますの単分子層である。この協会は、網膜疾患を研究する研究者に関心のRPEになります。 RPEはまた、相同性に向けられたDNA修復、P 国連アッセイの in vivoアッセイのサイトです。マウスの眼には、その小型サイズ（直径3.5ミリメートル程度）とその球形のために解剖することは特に困難です。この記事では詳細にRPEの全マウントをもたらす眼の解剖のための手順を示しています。この手順では、我々は目の球状構造、反対ではなく、操作する方法を示しています。簡単に言うと、結合組織、筋肉、および視神経は、眼球の後ろから削除されます。その後、角膜と水晶体が削除されます。次に、戦略的なカットが残っている組織の重要な平坦でその結果を作られています。最後に、神経網膜が優しくも、根底にある脈絡膜と強膜に接続されているそのままRPEを、明らかに、リフトオフさ。この全体のマウントは 、p 国連アッセイを実行したり、RPE組織の免疫組織化学または免疫評価のために使用することができます。

プロトコル

1。眼球の外から余分な組織を取り除く

  1. 35mmディッシュの蓋に1X PBSを注ぐ。レベルは、単に蓋の唇未満である必要があります。
  2. ストレートピンセットを使用して、35mmディッシュに蓄積管からの眼（s）を転送する。 1：目は2つの理由のためにPBSに浸漬されています。無関係な組織は、あなたが見ることができるので、目から離れて"フロート"と簡単にそれらを削除し、2になります。懸濁液中のまま解剖時には、目が自然にこの形状ではなく、それに対して作業できるように、その球状の形状を維持します。
  3. 直角鉗子（45 °と15 °）の両方のペアを使用して、静かに（角膜に向かってすなわち）穀物に対して組織を引っ張って、できるだけ多くの筋肉と結合組織として削除します。いくつかの結合組織が維持されます。努力は、できるだけ少ないとして眼球を圧迫するためになされるべきである。
  4. 春のはさみについては、15 °の鉗子を交換。 45 °の鉗子との着実な目を保持しながら、残りの筋肉や結合組織だけでなく、視神経を切り取るために春のはさみを使用してください。 *ヒント：トリムして木目に逆らって組織をプッシュするはさみの外側のエッジを使用してください（corneo -強膜の分周に向かって）と。すべての余分な組織を目から除去されるまで操作を続行します。

2。角膜と水晶体を取り除く

  1. 角膜を上に向けて、角膜の中心部に....

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ディスカッション

RPEは、相同性指向修理のin vivoアッセイでは、p 国連検定のサイトです。 P 国連アッセイは、相同性指向修理の周波数の異なるDNA損傷の1,2およびDNA損傷のシグナル伝達と修復遺伝子3,4,5の効果を研究するために使用されています。このアッセイでは、RPE 1の単一セルのイベントを検出する、高感度です。また、開発6時の相同性指向修理のイベントのタイミングの違いを検出することができます。マウスの眼は、視神経7から外側に放射状に発達し、そのため、視神経乳頭からのイベントの相対距離は、それらが発生した開発の時間に相関する。

RPEはまた、網膜の発生や網膜疾患を研究する人々への関心のです。 RPE細胞を培養することができますが、その際に重要な制限事項があります。大人のRPE細胞は有糸分裂後7ですと予想in vitroでうまく増殖しな.......

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開示事項

利害の衝突は宣言されません。

謝辞

この作品は、環境健康科学研究所によってサポートされていました[K22ES012264へAJRB]と米国癌協会InstitutionalResearchグラント[ACS - IRG - 00 - 173 - 04]パイロットprojectaward [AJRBへ]。我々はまたしてはいけないことの例については、原稿と特に映像とアダムブラウンのコメントの重要な読書のためにビショップの研究室のメンバーに感謝。私たちは、私たちに解剖のビデオの撮影用カメラのセットアップ彼の解剖スコープ/ビデオの使用を可能にするためGreehey小児がん研究所の博士ドナルドウェンに感謝。私たちは、シャープと私たちの顕微解剖ツールの修理のためコルテインスツルメンツでDaronブラウンに感謝する。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ストレートピンセットRoboz Surgical Instruments Co.RS-4903先端: .08 x .04 mm 材質: INOX
45°ピンセットRoboz Surgical Instruments Co.RS-5005先端: .05 x.01 mm 材質: INOX
15° "アップ"ピンセットRoboz Surgical Instruments Co.RS-5045A先端: .1 x.06 mm 材質: INOX
スプリング剪刀Roboz Surgical Instruments Co.RS-5604複合先端幅 0.3mm 刃渡り 3mm 材質: ステンレス鋼
双眼解剖顕微鏡Carl Zeiss, Inc.Discovery V.8落射照明を使用
ファロイジンInvitrogenA22283Alexa Fluor 546

参考文献

  1. Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
  2. Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H.

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