評価する in vivoで効果、方法、治療筋肉の力発生や易疲労性を定量するために必要とされる。我々は詳細植したマウスの後肢筋のミオ - 機械的性質を評価するアプローチを。この分析では、筋機能に関する遺伝子改変の影響だけでなく、筋肉の疾患のマウスモデルにおける治療法の比較を定量に強力なアプローチを提供します。
この記事について
サマリー
要約
筋肉の疾患1,2,3の治療のための治療的介入の in vivo効果を評価するために、定量的な方法が必要とされているその治療を受けた筋肉の力発生や易疲労性を測定する。我々は、マウスから新鮮な植後肢筋のミオ - 機械的特性を評価するための詳細なアプローチについて説明します。使用して、、そして最大の痙攣と強直性緊張、収縮時間、およびハーフ緩和時間の測定、我々は、筋肉ストリップミオグラフ（デンマークミオテクノロジーモデル820MS）の筋肉を取り付け、マウス指伸筋の筋筋の非外傷性収穫を記述方形パルス刺激（モデルS48、グラス技術）。これらの測定値を使用して、我々は特定のけいれんや筋肉の断面積で正規化強直性張力の計算、筋間の強縮張力の比、力周波数の関係の曲線と低周波の疲労曲線4を示しています。この分析は、筋肉の病気1,2,3,5だけでなく、筋肉の機能6,7,8,9の遺伝的改変の効果の比較のマウスモデルにおいて治療的介入の間に定量的に比較する方法を提供する。
プロトコル
プロトコルは、UCSF動物実験の承認を得て実施し、委員会（IACUC）を使用しています。
1。マウス指伸筋の筋 （EDL）筋肉の解剖
- 制度的なガイドラインに従って、すべての動物の手順を実行します。
- 筋肉の収穫は10〜直前に200 mg / kgを腹腔内子宮頸部/ペントバルビタール脱臼で動物を安楽死させる。解剖はよく筋肉が安楽死の15分以内に収穫し、緊張の変換器でマウントできるように練習してください。
- 解剖のトレイとトレイのピン脚の上で死体の仰臥位を手配する。
- 解剖顕微鏡、開いている皮膚、慎重に開いている筋膜（ 図1A）、そして足首から脛骨皮の下にEDL（ 図1b）を公開する上方。筋肉がしっとりと収穫の間にバッファを維持するために乳酸リンゲル液の滴を使用してください。
- EDLを削除する、それぞれの端に、できるだけ多くの腱として維持し、及び乳酸リンゲル液を含むペトリ皿に入れ。筋肉の腱（Fig.1C）の各々に縫合糸を接続します。それは筋肉の繊維が触れたり、解剖時に邪魔されないことが不可欠である。
2。筋肉のストリップミオグラフでマウスのEDLの取付け
- これらの研究のために、組織の風呂は、それが連続的な酸素化と一定の温度で生理的溶液中で入浴しながらことは筋肉を固定して必要とされる。お風呂は、筋肉の緊張の測定のための力変換器で結合されている。我々はこの目的のためにデンマークのミオテクノロジー（DMTモデル820MS）から統合された筋肉のストリップミオグラフバスを採用しています。さらに、方形パルス電気刺激装置（グラスモデルS48）とデータ収集プラットフォーム（ADInstruments PowerLabデータ収録システムとLabChartソフトウェア）はそれぞれ、ミオ機械的応答を記録して分析、引き出すために必要とされる。 DMT 820MSは、筋肉のストリップの中間部分で、筋肉の両側に配置されているチャンバーカバーに統合された白金電極を持っています。他のmyographsは、電極の配置に固有の注意が必要な場合があります。
- 5mLのクレブスヘンゼライト溶液11にミオグラフバスを埋める。 25℃くらいまで温め使用前に15分間入浴を通じてバブルO 2 / CO 2（95％/ 5％）。
- ミオグラフのクランプ間にEDLを拡張し、クランプ間EDL筋肉の腱（Fig.1D、E）を確保するために縫合糸を使用してください。筋肉自体を固定しないように注意してください。
- 25℃ミオグラフバスを維持℃に
3。ミオ - 機械的分析
A.の単収縮張力
- は筋肉の弛緩がないように槽内の初期の長さを設定します。
- 、最大の単収縮張力を得るために電圧を調整することによって、最大刺激（持続時間は0.5 ms）を決定するには、その後、最大上記の20％（最大上刺激を達成するために）で刺激を設定します。我々の研究では、最大上刺激は通常40ボルトの出力で達成される。
- オシロスコープを使って刺激からの出力を確認します。
- 単収縮張力にはさらなる増加がなくなるまで徐々に筋肉をストレッチすることにより最適な長さを決定します。
- 筋肉は3分間平衡させる。
- 最大上の正方形グラスS44電気刺激装置を使用して最適な長さの刺激（0.5ミリ）、およびレコードの出力を提供します。
- レコード：単収縮張力曲線（P T対時間、Fig.2A）。
B.破傷風緊張
- 筋肉は3分間休息することができます。
- グラスS44電気刺激装置を使用して最適な長さで150 Hzで300ミリ秒のための最大上刺激の列車、およびレコードの出力を適用する。
- レコード：破傷風の張力曲線（P O対時間、 図2b）。
C.フォース周波
- 筋肉は3分間休息することができます。
- 力周波数：それぞれの刺激（ 図3）の間に、残り3分で30、60、100、140、および160 Hzで最大上刺激の列車を適用する。また、電車は15、25、35、45、55、65、75、100、140と低い周波数での分解能は160 Hzの、力の変化が、実質的に適用されることがあります。
- プロット：力 - 周波数の関係（％最大力対刺激の周波数）。
D.疲労
- 短い破傷風菌の列車を適用する：300ミリ秒（または周波数ピーク力の50％を生産するように調整）は60 Hz、10分間毎に3秒。 10分では、破傷風の力は初期値（ 図4）の〜15％のプラトーレベルに低下するはず。
- プロット：低周波疲労（％最大の力対時間）。
プロトコルの最後にE.追加のデータ収集
- ミオグラフから筋肉をアンマウントする前に、MUSCを設定するルは、最適な長さでステップIII.A.4で決定され、顕微鏡やキャリパーのいずれかで眼を使用して、その直径を測定するように。断面積（μmの2）を計算する。
- 縫合糸を除去し、筋肉を比較検討することによって筋肉の質量（mg）を測定。
- 本体質量（GM）を評価するためにマウスを量る。
4。計算
- 筋肉：ボディの質量比=
筋肉量/ボディ質量 - 単収縮張力、P T（MN）=
けいれん時に生成される最大張力 - 特定の単収縮張力（N / cm 2）と=
単収縮張力（MN）/断面積（μm2と ）× 10 5 N / MN•μmの2 / cm 2で - ピーク張力の時間（ミリ秒）=
最大張力の収縮の発症からの時間 - ハーフ緩和時間（ミリ秒）=
ピーク張力のピーク張力の50％までの時間 - 強縮張力、P O（MN）=
破傷風中に生成される最大張力 - 特定の強縮張力（N / cm 2）と=
強縮張力（MN）/断面積（μm2と ）× 10 5 N / MN•μmの2 / cm 2で - 破傷風の上昇の最大速度（N / S）=
破傷風、すなわち、強縮張力曲線（または、DP O / DT）の最大傾斜でテンション上昇中の緊張の増加の最大速度 - ハーフ緩和の強縮張力（MS）=
刺激の停止からの刺激の終了時に緊張の50％までの時間 - 単収縮張力から強縮張力の比、P、T / P O =
最大単収縮張力/最大強縮張力 - 疲労指数=
最大等尺性張力の低周波疲労の2分後の張力の比
5。代表的な結果
図1。 EDL筋肉の解剖。後肢muscles.TA、前脛骨筋。B、EDLの露出（指伸筋屈筋）筋肉の、露出。C、EDL腱の縫合糸の添付ファイル。D、テンショントランスデューサバス（側面から見た図）。E、EDLはお風呂にマウント（上記から表示）。の筋肉は、不完全に例示目的のためのバッファーに浸漬し、実際には、筋肉が完全に乾燥から防ぐために浸漬する必要があります。
図2。張力曲線の例。最大の単収縮張力（P t）は、収縮時間（CT）とハーフ緩和時間（HRT）を示す単収縮張力曲線の、例。バー、1S。B、最大強縮張力を示す強縮張力曲線（P O）の例とハーフ緩和の強縮張力（HRTT）。バー、1S。
図3。力周波数の関係の解析の例。増分刺激の周波数で生成される、緊張が。B、30MHzの。バー、80ミリ秒。C、140MHzでパルス列の例でパルス列の例。バー、80ミリ秒。D、に示されているデータから得られる力周波数の曲線の例。力周波数の曲線の形状は筋肉の強さの特徴である、と別の動物から筋肉の間で比較することができます。
図4。低周波数の疲労解析の例。 、指示された時点（B、C、D）でのパルス列の低周波stimulation.Examplesの期間に生成された減分の緊張を以下に示します。Eは、に示されているデータから得られる低周波疲労曲線の例。低周波数の疲労曲線の形状は筋肉の強さの特徴である、と別の動物から筋肉の間で比較することができます。
ディスカッション
我々は、マウスからの外植後肢筋のミオ - 機械的特性を評価するための詳細なアプローチについて説明します。 EDLは、ために前脛骨筋の後ろに、その後方の位置から解剖することはより困難ながら、その顕著な腱の添付ファイルのために足首と膝の関節に脛骨の前方より評価することが容易です。これらの腱は筋肉のストリップミオグラフで取り付け容易。対照的に、より簡単にアクセスする前脛骨は 、両方の筋肉を損なうことなく解剖し、そしてミオグラフでしっかりとマウントすることは非常に困難に、膝関節で広い、ほとんどatendinous添付ファイルを持っています。我々はまた、急速に生理的緩衝液と温度で酸素浴で筋肉をマウントすることを指摘して筋肉の機械的性質を保持することが不可欠です。我々はこれらの条件の下で筋肉の応答が大幅に変更することなく、最大30分間この分析を繰り返すことができることを見出した。最後に、これが筋機能に悪影響を与える、とミオ機械的な力を過小評価する結果となることができるように筋線維は、解剖や取り付け手順中に触れられないことが不可欠である。これらの手順に従うことにより、この分析は、筋肉の機能6,7,8,9の遺伝的改変の影響だけでなく、筋肉の病気1,2,3,5のマウスモデルにおいて治療的介入との比較を評価するために堅牢な定量的なアプローチを提供。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、NHLBIからPEOへの公衆衛生サービスグラント（HL086513）、および再生医療（RC1 - 00104）のためのカリフォルニア工科大学、NHLBIから公衆衛生サービスグラント（HL085377）、およびギフトから包括的な研究助成金によってサポートされていましたポリン財団からHSBへ
SCは、サンフランシスコ州立大学への細胞の研究賞（TB1 - 01194）を食い止めるために再生医療の橋のためにカリフォルニア工科大学によってサポートされていました。
材料
ソリューションとメディア
乳酸リンゲル液
- 100mMのNaCl
- 30mMのCH3CH（OH）COONa（乳酸ナトリウム）
- 4 mMのKClを
- 1mMのCaCl 2 2H 2 O（塩化カルシウム二水和物）
- 6.75にpHを調整する
クレブスヘンゼライト溶液
- 118 mM NaClを
- 4.7 mMのKClを
- 1.25 mMのCaCl 2を
- 1.2 mMのMgCl 2
- 1.2 mmのKH 2 PO 4
- 25mMのNaHCO 3を
- 11 mMグルコース
- O 2 / CO 2（95％/ 5％）ガスとの平衡によって7.2から7.4にpHを調整する
ペントバルビタール
- 滅菌水で5 mg / mLの希釈標準溶液
参考文献
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再版と許可
