細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンV /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ

この手順は、500μLシリコナイズチューブまたは6 mLのポリスチレン丸底FACSチューブで行うことができます。他の手順と組み合わせて実行可能性分析を行う際に、後者は通常使用されます。与えられたすべてのボリュームは、6 mLのポリスチレン丸底FACSチューブ用です。 500μLシリコナイズチューブの場合は、1 / 5ですべてのボリュームを減らす。

フローサイトメトリー分析のための最適濃度は200μLボリューム2〜4 × 10 ^6個の細胞です。細胞の損失は、この手順からなることがありますので、我々は、各サンプルは、プロシージャの開始時に4 × 10 ^6個の細胞から構成されることをお勧めします。

1。細胞の準備

1. 収穫の細胞は - 対応する細胞株または初代細胞アイソレーションのための具体的な手順を参照してください。
2. 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。
3. 2 mLの1 ×リン酸に再懸濁し細胞（PBS）緩衝生理食塩水^{- / - （}無カルシウム、マグネシウムがない）。
4. 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。
5. 1 mLの1 ×アネキシンV結合バッファーで細胞を懸濁します。
6. 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。
7. 100μLの1 ×アネキシンV結合バッファーに再懸濁し細胞。

2。アネキシンV / PIのアプリケーションでは、染色

1. メーカーの推奨に従ってアネキシンVを追加する[例えば、5μLアネキシンVのAlexa Fluor ® 488（Molecular Probes社、A13201）]。
2. 室温で15分間暗所でチューブをインキュベートする。
3. 各反応チューブに1 ×アネキシンV結合バッファー100μLを加える。各チューブに約200μLがあるはずです。
4. 1 ×アネキシンV結合バッファー（10μL1 ×アネキシンV結合バッファーを持つ、すなわち1μLPI）で1:10に希釈されたPIの4μL（Sigma、カタログ＃P - 4864 - 10ML）を追加します。これは、各サンプルに2μg/ mLの最終的なPIの濃度が得られます。
5. 室温で15分間暗所でチューブをインキュベートする。
6. 細胞を洗浄するために、500μLの1 ×アネキシンV結合バッファーを追加します。
7. 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。
8. 500μL1 ×アネキシンVの結合緩衝液と1％のホルムアルデヒド（固定）ソリューションを作成するために500μLの2％ホルムアルデヒドで再懸濁し、細胞。穏やかなフリックでチューブを混ぜる。
9. 氷上で10分間サンプルを修正。また、サンプルは4℃で一晩保存することができます℃で暗所で。後者の方法が選択された場合、アネキシンV / PI（補償のコントロールを含む）で標識されたすべてのチューブ全体で一貫していることを確認します。
10. 各サンプルへとフリックにより穏やかに混合^{- / -} 1 mLの1 × PBSを追加。
11. 8分間425 × gでチューブを遠心し、上清をデカントする。
12. 手順2.10と2.11を繰り返します。
13. チューブをフリックしてペレットを再懸濁します。
14. 濃度50μg/ mlの最終濃度になるように1:100希釈のRNase A（シグマ、R4642）の16μLを追加。 37℃で15分間インキュベート℃に
15. ^{/ - -} 1 mLの1 × PBSを追加し、フリックにより穏やかに混合する。
16. 8分間425 × gでチューブを遠心する。
17. 現在、サンプルを分析する準備が整いました。アネキシン/ PI染色は他の手続きと並行して実行されている場合、あるいは、試料は、その後の染色工程のために使用することができます。

3。代表的な結果：

偽陽性のPI染色の度合いをした細胞タイプと細胞株の例を図1に示されています。偽陽性のイベントを考慮して、細胞を固定してから（図2B）RNase処理を受けていない細胞と比較して偽陽性のイベント、数の有意な減少でのRNase Aでこの結果を処理した。図2CはRNase処理を持たない細胞に比べて、RNase処理を受けた細胞の代表画像を示す。図3は、固定およびRNase処理のステップで変更されたアネキシンV / PIプロトコルは、偽陽性染色のイベントの数を制限することにより、従来のプロトコルを改良した方法を示しています。

図1。従来のヨウ化プロピジウム染色のプロトコルは、偽陽性のイベントのかなりの数につながる。我々は以前に動物モデルの広範なだけでなく、細胞株¹⁰の様々な主要な細胞間の偽陽性染色の程度を評価した。代表的な画像は、3つのユニークな細胞集団（ - RAWマクロファージおよびつの主要細胞 - マウス骨髄マクロファージ（BMM）と金魚の主腎マクロファージ（PKM）1つの一般的に使用される細胞株）における偽陽性染色の程度を示す。真陽性のイベントが核コンパートメント内でPIとDRAQ5の間に予想される共局在を（黄色の領域は、PIとDRAQ5の間で共局在を表す）が表示されます。 DRAQ5は非常に体肢です。NE透過性染料その生細胞と死細胞^10,11,12の両方で正確に汚れ核コンパートメント。共局在DRAQ5汚れを簡単に視覚的な決定のための緑のpseudocolourを与えられた。

図2。 PI核染色の精度を向上させる 。 （A）我々はDRAQ5に十分に特徴付けられた核染色（BrdUを、7 - AADとDAPI）の数の類似度に基づいて、PI核染色の精度を評価した。のBrdUは増殖細胞のDNAに組み込まれ、そのようにのみ核コンパートメント内に染色される合成ヌクレオシドである。 7 - AADは、PIと同様のDNAと、親和性の高い、無傷の原形質膜を越えることはできません。 DAPIは、DNAに強い親和性を有しており、蛍光顕微鏡で染色核の最も一般的に使用されています。類似度は正確にRAW 264.7マクロファージにおける細胞核を染色する能力を強調し、BrdUを、7 - AAD、DAPIとDRAQ5との間で> 99％であった。対照的に、従来のプロトコルに基づいて細胞質PI染色はDRAQ5に相対的染色のパーセント類似性の著しい低下につながる。マウス骨髄マクロファージ（BMM）と金魚の主腎マクロファージ（PKM）：（B）も同様の結果が試験された2つの主要な細胞で観察される。染色手順内の特定の段階では50μg/ mlのRNaseの混入は非核兵器PI染色を削除し、大幅にDRAQ5染色の相対類似度を増加させる。 （C）一次性腎マクロファージの代表的な画像は、RNase処理がある場合とない場合のセルの類似度を示す。治療法の違いを簡単に視覚的判定のために、DRAQ5は緑色を与えられた。黄色の領域は、BrdUとDRAQ5、およびPIとDRAQ5の間で共局在を表しています。

図3。修正されたアネキシンV / PIは大幅に偽のアポトーシス/壊死性イベントを減少します。主な金魚の腎臓のマクロファージ（PKM）は、従来と変更されたアネキシンV / PIプロトコールで染色した。散布図はアネキシンV / PIは、金魚のPKM​​に染色描く。左の散布図は、PKM細胞の従来のアネキシンV / PI染色（無RNaseを）示しています。右上の散布図は、変更されたアネキシンV / PIプロトコル（RNaseの）で染色PKM細胞を示しています。偽陽性の汚れの除去に起因するPI染色の顕著な減少中のRNaseの結果の追加。 PKM細胞は、培養液、初期の前駆細胞（EP）、単球（モノ）と成熟し​​たマクロファージ（マットMAC）内の異なる個体群に基づいて分析した。偽陽性のイベントの除去に起因する正のPIのイベント数の減少は、より小さな早期の前駆細胞に比べて大規模な成熟したマクロファージ細胞においてより顕著である。従来のプロトコルに基づいて結論が誤って、より成熟したマクロファージサブセットの細胞死に正の相関を示唆しているでしょう。