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Summary

マウス精巣から高度に精製された実行可能な減数分裂分画を得るために効率的な方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）による洗練された細胞解離のプロトコルを組み合わせています、説明されています。このメソッドは、離散的な減数分裂画分のDNA含量の違いと核密度を利用しています。

Abstract

精巣の細胞型の異種性質と減数分裂細胞培養モデルの不在は、減数分裂時のマニフェストの一意の分化プログラムの研究に大きなハードルとなっている。 BSAおよび/またはパーコール勾配を使用して水簸またはStaput（沈降）：二つの主要なメソッドは、程度の差は、成人および幼若動物の両方から様々な減数分裂分画を精製するために開発されている。これらのメソッドの両方は^1-5減数分裂細胞を分離するためにセルサイズと密度に依存しています。全体的に、少数の細胞集団⁶を除いて、これらのプロトコルは、詳細な分子解析のために必要な多数の減数分裂細胞集団の十分な純度を得るために失敗する。また、そのような方法で減数分裂細胞の通常一種類は、減数分裂細胞のサンプルを比較するときに再現性と均質性に関する複雑さの余分なレベルを追加する所定の時間、で精製することができる。

ここでは、ヘキスト33342染色^7,8と組み合わせてFACSを用いて、生殖細胞から円形精子細胞に、1つは簡単に、視覚化、識別、および減数分裂細胞を浄化するための洗練された方法を説明します。このメソッドは、全体の減数分裂過程の全体のスナップショットを提供し、一つ非常に減数分裂の最もステージから生細胞を浄化することができます。これらの精製された細胞は、その後、遺伝子発現^9,10と減数分裂組換え¹¹のホットスポットでのヌクレオソームの占有率のダイナミクスの例の変更については、減数分裂を通しての進行に伴う分子の変化を詳細に分析することができます。

Protocol

このプロトコルは2つの主要なステップに分けることができる：（1）に続くマウス精巣細胞の解離とヘキスト33342染色は、必要に応じて、（2）FACSでの生殖細胞から、減数分裂のすべての段階を含む、関連する減数分裂分画、のソート円形精子細胞。が収集されると、これらの高度に濃縮さ減数分裂集団は、分析の広い範囲に使用することができます。このプロトコルは、大人一人の精巣の解離を説明し、ボリュームは少年のためにまたは追加の精巣のためのそれに応じて適応させることができる。

1。精巣解離

1. 片足で15 mlのチューブに精巣をカプセル化が解除。
2. コラゲナーゼタイプI 120 U / mlを含有するGeyのバランス塩溶液（GBSS）の3 mlを加え
3. DNアーゼI（50％グリセロールで1mg/mlのストック溶液）10μlを追加し、解離し始めて精巣細管が表示されるまで、手で強くそれを振る。
4. 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する
5. 室温で垂直方向に1分間デカントして上清を捨てる。
6. 1.5手順1.2を繰り返します。
7. コラゲナーゼI型、1mMのHCl溶液、およびDNase I（1mg/ml）10μlに再懸50mg/mlトリプシンストック溶液の50μlを、含むGBSS 2.5 mlを加え、チューブを数回転倒。
8. 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する
9. 広い開口部とプラスチック製の使い捨てのパスツールピペットを用いて、ピペットで静かに上下3 min.No塊のためのこの時点で表示されるはずです。
10. トリプシン30μlの、DNアーゼI、DMSO（10 mg / mlの）中に再懸濁しヘキスト3334240μlの、10μlを加え、チューブを数回転倒。
11. 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する
12. ウシ胎児血清（FCS）の400μlを加え、トリプシンを不活性化するために転倒混和する。
13. 最終的な染色はヘキスト3334250μlのDMSO（10 mg / mlの）中に再懸濁し、およびDNase I（1 mg / ml）を10μlを添加することにより行われます。
14. 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する
15. 解離精巣サンプルはその後、2つの40μmのGBSS 50 mlコニカルチューブオーバープレ接液使い捨てフィルターを通過され、次に5ヨウ化プロピジウムの溶液（PI）溶液を加え、サンプルを穏やかに使い捨てのパスツールで数回ピペッティングして混合され、ピペット。
16. サンプルを18ゲージの針を通して5 mlのプラスチック注射器に転送されます。後者は、サンプル配信のために22ゲージ針で置き換えられます。注射器は、氷上で保存し、FACSの処理のための準備が整うまで、光から保護されています。

2。 FACSのセットアップおよび精製

1. 並べ替えは、ベクトンディッキンソン-アリアIIUのセルソーターを行った。説明された条件は、したがって、異なる機器を使用して、特に出発点として使用する必要があります。我々は以前に^7,8を説明した条件を使用していました。
2. アリアIIUはUVレーザーを持っていないので、我々は前方および側方散乱を検出するために488nmの青色レーザーを使用するほかに、405nmのバイオレットレーザーを使用してHoescht染色を検出するためのプロトコルを適応した。さらに、一部のフィルタが改良された散乱プロットの鋭さで、その結果、いくつかの赤色レーザーの漏出を制限するために変更されました。
3. バイオレットレーザーはHoescht青色発光を検出するための450/40nmバンドパスとHoeschtレッド放出の585/42nmバンドパスで構成されました。 502nmロングパスは赤色蛍光から青を分離するために使用されていました。
4. 100μmのノズルは、28000滴/秒のドロップ駆動周波数で使用されました。サンプルのしきい値の率は、約4000イベント/秒であった。温度制御のオプションが4で、サンプルとコレクションチューブを維持するために使用された℃でのソートの全体の持続時間。さらに、サンプルの攪拌機能がソート全体の沈降からサンプルを防止するために200rpmで使用されていました。
5. 通常2〜3精巣は各人口に対して0.5〜2.0×10 ^6個の細胞（代表的なセクションを参照）の収集を可能にする6時間のソートごとに処理されました。
6. サンプルは、シリンジから分配さ約750μlのアリコートでソートされた。一方、これらの中にコレクションチューブを、4℃に保たれた光から保護され、ゆっくりと前に再開ソートに混合した一時停止します。
7. ソートされたサンプルは、10％FCSを添加した250μlのDMEMを含む12x75mmガラスborosilicatedコレクションチューブに回収した。

3。代表的な結果：

典型的なFACSプロファイルを図1に示されています。減数分裂の主な手順のすべてが識別され、凡例に示されます。ヘキスト33342染色液が最適でない場合は、グローバルプロファイルは、よりコンパクトに表示され、以下に定義されます。一般的な問題は、急速な細胞の凝集を誘発するに十分なDNaseを、追加しないことを考えています。すべての起訴のステップで余分なDNaseの添加は、通常、この問題を解決します。凍結番目DNアーゼ在庫切れawing（-20℃で保存）酵素活性の急速な損失でこの結果として、最小限に抑える必要があります。

Spo11は減数分裂組換えのホットスポット¹²の部位で二本鎖切断を指示する減数分裂エンドヌクレアーゼである。 図2は放棄減数分裂¹²にその結果、形成されただけでなく、されていない二重鎖切断Spo11 -ヌル精巣の典型的なプロファイルを示しています減数分裂のこの最初の波の非同期な性質を明らかに、13日齢マウスのプレpuberousプロファイル。シナプトネマ複雑なタンパク質3（SCP3）とリン酸化ヒストンH2AX抗体のステージ固有の減数分裂のマーカーの組み合わせを使用して標準的な細胞遺伝学的解析は、最初elswhere ^11を説明するように、ソートされた減数分裂細胞の純度や性質を確認するために使用する必要があります。

図1野生型減数分裂のFACSプロファイル。 A）代表的な散布図が表示されます。ゲートのセルが表示されます。主に空の膜と精子細胞の尾を含む成人精巣内に存在する破片が大量に注意してください。 B）代表的なPIのプロットは試料中に存在するPI陽性細胞のごく限られた量を示しています。典型的なゲートが表示されます。 C）代表的な野生型ヘキスト33342 FACSプロファイルが表示されます。さらなる研究のためにこの方法を用いて精製することができる様々な減数分裂細胞集団が示されている：精原細胞（SP）、プリ細糸期（PL）、細糸期、接合期（L / Z）、早期パキテン期（EP）、ミドルパキテン期（ MP）、後期パキテン期（LP）、複糸期（D）、及び円形精子細胞（RS）。

図2。Spo11 – nullと野生型の13日目減数分裂FACSプロファイル。 A）典型的なSpo11 – nullのプロファイルは、接合糸期/細糸期早期パキテン期過去のないステージが検出されないことができる明確な減数分裂の失敗、と示されています。 B）13日齢の野生型雄マウスのプロフィールは、細糸期/接合糸期の細胞の高濃度を示しています。減数分裂のこの最初の波は、明確にこの手法を用いて可視化ではなく、非同期です。

Discussion

本明細書において提示されるプロトコルは、研究者がこの基本的なプロセスのダイナミクスを研究することができます、1つは同時に成体雄マウスから非常に高純度で減数分裂段階の細胞の範囲全体を浄化することができます。精製された細胞は、RNA抽出^9,10、ヌクレオソームマッピング^11、組換え分子の検出、タンパク質解析、および多くに至るまで多数のアプリケーションに使用することができます。しかし、検出方法は、精製された減数分裂細胞の量に適合させる必要があります。また、この方法の高い再現性と、それは特定の実験に必要な材料の量を増やすために、異なる日に行われた同じ割合のプールに複数の独立したソートに可能です。また、この方法は1つが急速に遺伝子ノックアウト、発達の進行の収差、または（ 例えば 、照射減数分裂に影響を与えることを目的とする特定の治療の効果の効果を評価することができます全体の減数分裂過程のユニークなビジュアル表現、と研究者を提供する、または小分子阻害剤による治療）。

このプロトコルの重要なステップは、（i）大幅に細胞塊及び凝集体を避けることによって、細胞選別を容易に十分なDNアーゼ、、そして効率的に減数分裂段階の細胞の様々な集団を区別する必要がある（ⅱ）一貫したヘキスト33342染色の使用である。さらに、FACSのオペレータは、最適なビデオで、図1に示すようにプロファイルと詳細を取得するために彼らの楽器をセットアップするために、減数分裂細胞選別の仕様と特殊性を理解する必要があります。可能な変更は、バイオレットレーザーに最適化されているステイン新しいVybrant DyeCycleのバイオレット（Invitrogen社）とHoechst 33342を代用するかもしれない。しかし、全体的なプロファイルが大幅に変更することは期待できないでしょう。最後に、それが使用される組織の性質のためにそれを注意することも重要である、典型的な手順は、セルのソートに加え、追加の後のソート操作のために減数分裂細胞に4〜6時間を準備する1 ½時間がかかります。

Materials

Collagenase Type-1	Worthington Biochemical	CLSS1	Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C
Trypsin	Worthington Biochemical	TRL3	Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C
DNAse I	Sigma-Aldrich	DNEP	Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C
Gey’s Balance Salt Solution	Sigma-Aldrich	G9779
6" Transfer Pipet	Fisher Scientific	137119D