当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。
多くの努力は、機能的な小径動脈バイパスを再生成する方法論を開発し、推進することに専念してきました。生理的環境では、両方の機械的および化学的刺激が動脈血管の1,2の適切な開発と機能性を維持することが義務付けられています。
私たちのグループによって開発されたバイオリアクター培養システムは、ネイティブの船のことを模倣する正確に制御された化学機械環境の中で血管の再生をサポートするように設計されています。私たちのバイオリアクターの組み立てとメンテナンスの手順はかなり簡単と3,4 –再現性の高いです。平滑筋細胞(平滑筋細胞)に準拠したシリコンチューブを介してスレッド化と、最大12週間までのために拍動性刺激の有無にかかわらず、バイオリアクターで培養されている管状のポリグリコール酸(PGA)のメッシュに播種されています。いくつかの前任者から私たちのバイオリアクターを区別する4つの主要な属性があります。 1)唯一のネイティブ血管の周囲の生化学をシミュレートする他の培養システムとは異なり、私たちのバイオリアクターは、また文化の容器に循環半径方向ひずみを適用することにより、生理的拍動性の環境を作成します。 2)複数の人工血管は、制御された化学物質の環境内のさまざまな機械的な条件の下で同時に培養することができる。 3)バイオリアクターは、簡単に動物の移植モデルのための人工血管の内腔側上に塗布される内皮細胞の単層(EC)が可能になります。 4)私たちのバイオリアクターは、異なる直径の大きさと文化エンジニアリング船舶は、特定の直径のサイズに合わせて個々のバイオリアクターを調整する手間が省けます、1mmから3mmまでであったができます。
私たちのバイオリアクターで培養した人工血管はある程度組織学的にネイティブの血管に似ている。血管壁の細胞は平滑筋ミオシン重鎖(SMMHC)3のような成熟したSMC収縮マーカーを発現する。コラーゲンはかなりの量の人工血管5の究極の機械的強度を担当する細胞外マトリックス内に堆積される。生化学分析はまた、人工血管のコラーゲン含有量は、ネイティブ動脈6と同等であることを示します。重要なのは、拍動性のバイオリアクターは、一貫して動物モデル3,7で成功した移植実験を許可する機械的性質を示す血管を再生成しています。さらに、このバイオリアクターは、さらに非線形光学顕微鏡(NLOM)8を使用して 、非侵襲的に、時間の経過とともにコラーゲンのリモデリングのリアルタイム評価と追跡を許可するように変更することができます。結論として、このバイオリアクターは、機能的な小口径人工血管の再生を制御する基本的なメカニズムを研究するための優れたプラットフォームとしてご利用ください。
オートクレーブ
図1及び図2に指示フローシステムとバイオリアクターの成分(バイオリアクター自体とシリコンストッパーの蓋)のためのチューブを組み立て、オートクレーブ。栄養チューブは、一端にオスコネクタと反対側の開放端を持っています。 3つのショートチューブセグメントはガス交換のためのシリコンキャップを通して挿入されています。
1。縫製PGAメッシュ
2。 PGA足場表面処理
3。ミシンダクロンアーム
4。バイオリアクターのアセンブリ(バイオリアクターの培養開始前日)
5。 1日目:バイオリアクターのセットアップ
6。日6-7:ポンプをオンにし、まず食べさせる
最初の給餌
7。代表的な結果:
図1。フローシステムのアセンブリのためのチューブとコネクタを上に示します。
図2。シリコンストッパーの蓋のアセンブリを上に示します。
図3。バイオリアクターアセンブリの回路図は、上記示されています。バイオリアクターのダクロンの袖口が青縫合の結び目を持つガラスの腕に固定されている内側。
図4。チューブとバイオリアクターに接続されているフローシステムは、上記の通りです。L/S18チューブがMasterflexポンプで汲み上げ、したがって流れを駆動されます。圧力トランスデューサは、上流でのバイオリアクターに入る前に圧力を測定します。
図5。収穫された人工血管の画像。エンジニア船舶が不透明であることが表示され、拍動性の条件下で8週間の培養後、約250μmの壁の厚さを実現します。
図6。人工血管のヘマトキシリンおよびエオシン染色したクロスセクションでは、。とBはそれぞれ、容器の8週間の非パルスとパルスです。CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 Lは、血管の内腔側を示している。スケールバーは100μmのです。
図7。人工血管の断面のためのコラーゲン(青)のためのマッソントリクローム染色。AとBはそれぞれ、8週間の非パルスとパルスの船舶です。 CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 4週間のパルス船舶がその非パルスのものよりコラーゲンを示していることに注意してください。白い矢印は血管内の残りのPGAのフラグメントを指す。スケールバーは100μmのです。
図8。ウシ人工動脈におけるSMCのマーカーの免疫染色。平滑筋α-アクチン、カルポニン- 1、および平滑筋ミオシン重鎖(SMMHC)はそれぞれ、、初期の中間、そして後半SMC収縮マーカーです。 12週間の文化の終わりまでに、容器内の細胞壁に発現するSMα-アクチンとカルポニン- 1とSMMHCの適量。スケールバーは20μmのです。
コンポーネント | 量は |
DMEM(DME /低に変更) | 500ミリリットル |
FBS(ウシ胎児血清)熱不活性化 | 100ミリリットル |
HEPES、1.0 M | 5ミリリットル |
ビタミンC(PBSまたはDMEMに溶解) | 25mgの |
プロリン/グリシン/アラニン25 mg/25 mg/10ミリグラム(PBS 5mlの溶解) | 5ミリリットル |
のCuSO 4は1.5μg(PBSのIN1 mlを溶解) | 1ミリリットル |
ペニシリン10,000台で、G / mlの | 5ミリリットル |
10ng/mlでのPDGF – BB(血小板由来成長因子- BB) | 5μg |
10ng/mlでのbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子) | 5μg |
表1。 "40〜10"培地の成分は、上記の表に示します。PDGF – BBとbFGFの例外を除き、他のすべてのコンポーネントは使用前に0.2μmのフィルターでろ過することです。
人工血管の品質は、組織培養で使用されている平滑筋細胞の品質によって決まる大部分です。 SMC表現型の重要な側面は収縮形態、低継代数、およびバイオリアクターの内部に増殖する能力が含まれています。我々は、継代数がポリマー骨格に細胞播種の時にP3以下であることをお勧めします。また、SMCソースを使用する前にマイコプラズマフリーであることを確認することが重要です。我々はマイコプラズマで汚染された細胞はバイオリアクターの培養中の細胞増殖およびコラーゲンマトリックスの沈着を大幅に減少につながることを観察した。
40万人以上の冠動脈グラフトは小径(<6mm)の人工血管12の需要が高い、その結果、毎年のバイパス操作のために必要です。究極の目標は、ネイティブ組織の生理的機能を模倣する機能小径血管を設計することです。私たちの拍動性のバイオリアクターシステムは、病気の動脈を復元し、置き換えることができる機能的な動脈グラフトを構成するための有望な平均値です。化学的および機械的に制御された環境では、バイオリアクターは、私たちは強力な縫合糸の保持と優れた機械的性質を示す埋め込み型細径船を設計することができます。拍動性のバイオリアクターシステムは、このように、このシステムの一般化と汎用性を作り、様々なサイズと寸法にウシ3、ブタ6,7、およびヒト細胞9から動脈を再構築するために使用することができます。さらに、我々は非侵襲的に血管の細胞外マトリックス、8のリアルタイム撮像を可能にするために私たちのバイオリアクターを変更しました。私たちのバイオリアクター、非侵襲的な顕微鏡イメージング技術、および高度な生体力学的評価の組み合わせアプローチは、私たちは時間をかけてECMの沈着と血管の機械的特性の変化を理解し、評価するのに役立ちます。
したがって、このバイオリアクターシステムは、将来の臨床応用10,11で自家血管移植片の再生に重要な役割を果たしている可能性生物学ベースの人工血管を設計するためにユニークなアプローチを提供しています。
The authors have nothing to disclose.
FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |