拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Summary

当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。

Abstract

多くの努力は、機能的な小径動脈バイパスを再生成する方法論を開発し、推進することに専念してきました。生理的環境では、両方の機械的および化学的刺激が動脈血管の^1,2の適切な開発と機能性を維持することが義務付けられています。

私たちのグループによって開発されたバイオリアクター培養システムは、ネイティブの船のことを模倣する正確に制御された化学機械環境の中で血管の再生をサポートするように設計されています。私たちのバイオリアクターの組み立てとメンテナンスの手順はかなり簡単と^{3,4 -}再現性の高いです。平滑筋細胞（平滑筋細胞）に準拠したシリコンチューブを介してスレッド化と、最大12週間までのために拍動性刺激の有無にかかわらず、バイオリアクターで培養されている管状のポリグリコール酸（PGA）のメッシュに播種されています。いくつかの前任者から私たちのバイオリアクターを区別する4つの主要な属性があります。 1）唯一のネイティブ血管の周囲の生化学をシミュレートする他の培養システムとは異なり、私たちのバイオリアクターは、また文化の容器に循環半径方向ひずみを適用することにより、生理的拍動性の環境を作成します。 2）複数の人工血管は、制御された化学物質の環境内のさまざまな機械的な条件の下で同時に培養することができる。 3）バイオリアクターは、簡単に動物の移植モデルのための人工血管の内腔側上に塗布される内皮細胞の単層（EC）が可能になります。 4）私たちのバイオリアクターは、異なる直径の大きさと文化エンジニアリング船舶は、特定の直径のサイズに合わせて個々のバイオリアクターを調整する手間が省けます、1mmから3mmまでであったができます。

私たちのバイオリアクターで培養した人工血管はある程度組織学的にネイティブの血管に似ている。血管壁の細胞は平滑筋ミオシン重鎖^（SMMHC）3のような成熟したSMC収縮マーカーを発現する。コラーゲンはかなりの量の人工血管⁵の究極の機械的強度を担当する細胞外マトリックス内に堆積される。生化学分析はまた、人工血管のコラーゲン含有量は、ネイティブ動脈⁶と同等であることを示します。重要なのは、拍動性のバイオリアクターは、一貫して動物モデル^3,7で成功した移植実験を許可する機械的性質を示す血管を再生成しています。さらに、このバイオリアクターは、さらに非線形光学顕微鏡^{（NLOM）8を}使用^して 、非侵襲的に、時間の経過とともにコラーゲンのリモデリングのリアルタイム評価と追跡を許可するように変更することができます。結論として、このバイオリアクターは、機能的な小口径人工血管の再生を制御する基本的なメカニズムを研究するための優れたプラットフォームとしてご利用ください。

Protocol

オートクレーブ

図1及び図2に指示フローシステムとバイオリアクターの成分（バイオリアクター自体とシリコンストッパーの蓋）のためのチューブを組み立て、オートクレーブ。栄養チューブは、一端にオスコネクタと反対側の開放端を持っています。 3つのショートチューブセグメントはガス交換のためのシリコンキャップを通して挿入されています。

1。縫製PGAメッシュ

1. 1.1センチメートルX〜8cmのシート（バイオリアクターのサイズに依存）にPGAメッシュを切る。
2. 蒸留水（・ Alarm_D）および使用する前に、乾いた空気ときれいなシリコンチューブ（3ミリメートル内径）。
3. シングルステッチに続く3つの手術のノット​​で始まるクリーンなシリコンチューブの周りにPGAメッシュを縫うためにDexon 6.0縫合糸を使用してください。

2。 PGA足場表面処理

1. 1 - 2分、処理時間を記録し、すべてのPGA足場に同じ時間を使うための1MのNaOHのディップPGA足場。
2. 2分間3回dH2O風呂でPGA足場をすすぐ。
3. パットPGAはのdH ₂ Oバスの各ディップの間にキムワイプで乾燥した足場。
4. 組織培養フードの下で乾燥したPGAは、足場上に....

Discussion

人工血管の品質は、組織培養で使用されている平滑筋細胞の品質によって決まる大部分です。 SMC表現型の重要な側面は収縮形態、低継代数、およびバイオリアクターの内部に増殖する能力が含まれています。我々は、継代数がポリマー骨格に細胞播種の時にP3以下であることをお勧めします。また、SMCソースを使用する前にマイコプラズマフリーであることを確認することが重要です。我々はマイコプラズマで汚染された細胞はバイオリアクターの培養中の細胞増殖およびコラーゲンマトリックスの沈着を大幅に減少につながることを観察した。

40万人以上の冠動脈グラフトは小径（<6mm）の人工血管¹²の需要が高い、その結果、毎年のバイパス操作のために必要です。究極の目標は、ネイティブ組織の生理的機能を模倣する機能小径血管を設計することです。私たちの拍動性のバイオリアクターシステムは、病気の動脈を復元し、置き換えることができる機能的な動脈グラフトを構成するための有望な平均値です。化学的および機械的に制御された環境では、バイオリアクターは、私たちは強力な縫合糸の保持と優れた機械的性質を示す埋め込み型.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	サプライヤー	カタログ番号
FBS（ウシ胎児血清）熱不活化	HyClone	SH30071
DMEM	GIBCO	11885
rhFGF -基本	R＆B	234 - FSE
rrPDGF - BB	R＆B	520 - BB
Penicilin G	シグマ	ペンナ
硫酸銅（II）	シグマ	C8027
Gylcine	シグマ	C8790
L -アラニン	シグマ	A7469 - 25G
L -プロリン	シグマ	P5607 - 25G
アスコルビン酸	シグマ	A4544 - 25G
HEPES	シグマ	H3375 - 100G
シリコンストッパー	コー​​ル - パーマー	06298〜24
MasterflexチューブL / S	コー​​ル - パーマー	06508〜16、06508〜18
Masterflexポンプ	コー​​ル - パーマー	7553〜80
ダクロンのカフ	MAQUET	174406
PGAフェルト	コンコルディア	MO000877 - 01
4から0まで1.5メートルSurgipro II縫合	Syneture	VP - 557 - X
6から0 0.7メトリックDexonの縫合	Syneture	7538〜11
0.22μmのPTFEフィルター	ワットマン紙	6780-2502
スリーウェイストップコック	エドワーズライフサイエンス	593WSC
圧力トランスデューサー	エドワーズライフサイエンス	PX212
IVバッグ	バクスター	R4R2110
生理食塩水希釈セット	矢印	W20030
シリコンチューブ	サンゴバン	F05027