固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

サマリー

ここでは、固体プレートベースの食事制限を行うためのプロトコルを提示 C.エレガンス死菌で。

要約

栄養失調や飢餓のない食物摂取の減少は、寿命を向上させ、哺乳動物を含めた種の広い範囲で様々な加齢に伴う病気の発症を遅らせることが知られている。また、体重と生殖能力の低下だけでなく、血漿グルコース、インスリン、およびこれらの動物におけるIGF - 1の低いレベルになります。この治療はしばしば、食事制限（DR）やカロリー制限（CR）と呼ばれています。線虫Caenorhabditis elegansは老化の生物学を研究するための重要なモデル生物として注目されています。環境と遺伝子操作モデルDRに使用されてきたとCで寿命を延ばすことが示されている両方エレガンス 。しかし、C言語で報告されたDRの研究の多くエレガンスは、加齢分野における遺伝学的研究のほとんどはペトリ皿の標準固形寒天上で行われた一方、液体培地で動物を伝播することによって行われた。ここでは、死菌と標準固体NGM寒天ベースのプレートを使用してDRのプロトコルを提示する。

プロトコル

1。細菌の濃度を推定するための検量線の確立

このセクションでは、C言語の食事制限の実験のための食料源として使用される任意の細菌株（例えば、OP50、HT115）のための細菌の濃度を推定する方法を説明しますエレガンス 。別々の検量線は、株が使用されている各細菌のために確立されるべきである。

1. E.のシングルコロニーを植菌大腸菌 OP50細菌は、3 mLの液体LBブロス中のLB寒天培地上の細菌の新鮮な筋から選んだ。
2. 場所OP50 37文化℃のシェーカーと細菌が一晩増殖することができます。
3. 一晩培養液からの細菌懸濁液（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍速）の連続2倍希釈液を調製する。
4. 三重での分光光度計により600 nmで、各希釈液の吸光度（光学密度）を測定します。
5. さらにそれぞれの細菌懸濁液100万倍（1000倍希釈倍）希釈する。
6. 100mmのLB寒天プレート上に均等に各希釈液の細菌懸濁液0.4 mLを広げる。
7. 18〜24時間、37℃インキュベーターでOP50のある場所LBプレートを。
8. 各プレート上で生育した細菌のコロニーの数を数えます。コロニー数は、各サンプルに対してmL当たりのcfu（コロニー形成単位）の計算に使用されます。
9. 測定OD ₆₀₀の値とOP50細菌濃度との関係は、細菌濃度（CFU / mL）をの関数としてOD _600をプロットし、線形回帰分析（図1）を実行することによって確立することができます。

ソリューション：

ルリアブロス（LB）、1L：
10グラム	バクトトリプトン
5グラム	酵母エキス
10グラム	NaClの

1Lに脱イオン水を追加。
オートクレーブ、室温で保管。

2。固体プレートベースの食事制限（SDR）プレートの調製

このセクションでは、固体プレートベースの食事制限（SDR）の実験で使用するためのプレートの準備について説明します。通常は、我々は、条件と1この方法のための最適なDRの給餌条件として× 10 ⁸ CFU / mLの送りを自由に摂取として1 × 10 ¹¹ CFU / mLの細菌の濃度を考慮してください。しかし、4-6異なる細菌の濃度は、SDRとその応答のための完全な用量依存関係を確立するために必要な場合があります。

1. E.のシングルコロニーを植菌3 mLの液体LBブロス中の大腸菌 OP50細菌。
2. 37℃のシェーカーでOP50文化を置き、細菌が6〜8時間のために成長することができます。
3. 500mLのLBブロスを含む新しいフラスコにOP50文化を転送し、℃でシェーカー一晩37に戻ってOP50文化を置きます。
4. 細菌濃度（濃度は第1部で生成された検量線を用いて計算される）を決定するOP50文化のOD _600を測定する。適切な希釈液は吸光度の正確な測定のために必要になる場合があります。
5. 20分1,500 gで遠心分離によってペレットOP50細菌。
6. 1 × 10 ¹² CFU / mLの濃度にバクテリアを再懸濁します。
7. 6つの異なる濃度で10 mLの細菌の培養を準備：1 × 10 ^{12、10 11、10} 10、10 ^{9、10 8、10 7} CFU / mLの。
8. 60mmの中央に細菌の培養のピペット0.2mLのは、NGMプレートを固めた。表面に打痕が寒天プレートに穴にワームを許可するように、ピペットチップとプレートの表面に触れないようにしてください。
9. 1時間37℃のインキュベータ内の場所のプレート。
10. 細菌の増殖を阻止するために、各プレートに100mg/mLカルベニシリン及び50mg/mLのカナマイシン10μLの10μLを適用します。
11. 4の抗生物質 - 死菌の異なる濃度° C今後の使用のために（最大1ヶ月）。と店舗プレート少なくとも1〜2日後に控えて全体の計画的な実験のための十分なプレートを準備して格納することが重要です。全体の実験のための板の同じバッチを使用することが望ましい。
12. 細菌の生存性を確認するには、SDRのプレートのいくつかの細菌をこすり取ってカルベニシリンおよびカナマイシンによる空のNGMプレート上に広げる。 6-8時間、37℃のインキュベーターでプレートを配置し、細菌の増殖（ない細菌の増殖が観察されないはず）を確認してください。

ソリューション

線虫の増殖培地（NGM）、1L：
3グラム	NaClの
2.5グラム	バクトペプトン
20グラム	寒天

ove_contentは"> 40分間オートクレーブし、65に冷却させ° C、その後に追加：

1 mLの	1 M MgSO 4を
1 mLの	1 M CaCl 2を
1 mLの	5 mg / mLのコレステロール
25 mLの	1Mリン酸カリウム、pH6.0の

すぐに10mLのアリコートで60ミリメートル× 15ミリメートルのペトリ皿に水などの液体NGMを注ぐ

3。 SDRの実験のセットアップ

このような寿命の解析と出生率のプロファイリングとして、SDRに関連する研究、のほとんどは、ワームの年齢同期人口の準備が不可欠です。他の研究では、単に食事制限を開始するために、SDRの板に定期的なOP50プレートからワームを転送する。このセクションでは、SDRの動物のために寿命の解析を設定するプロトコルを例として説明されています。

1. OP50でいくつかの定期的なNGMプレート上に20〜30生殖アクティブな大人を転送するためにプラチナのワームピッカーを使用してください。実験に必要な卵の数に応じて、より多くの大人が必要になることがあります。
2. 20℃でプレートを残す℃で4時間は、産卵を可能にする。
3. プレートから成人を取り外します。プレートを視覚的に卵のために点検してください。
4. 20℃でプレートを残し° Cと子孫がLate-L4/day大人1名のステージに発展することができます。通常、これは20℃N2野生型のワームのために3日かかる℃に
5. 食事制限を開始するSDRのプレートに1日成人の適切な数を転送する。
6. 寿命の分析については、各SDR条件のプレート当たり10から20までのワームで6〜8枚の合計を設定します。
7. すべてのワームが死亡するまで2日ごとにそれぞれのワームの実行可能性を得点する。それは、ワームは、食品の完全な剥奪を避けるために、すべての12から48時間新鮮なSDRの板に転送することが重要です。

4。代表的な結果：

図1に示すようにOD ₆₀₀との関係でOP50濃度の推定のための代表的な検量線のプロットである。ライナーの回帰分析によって生成された方程式は、OP50細菌濃度の将来のすべての計算に使用することができます。図2に示すように、別のワームの株の平均寿命に慢性SDRの治療の効果を測定することの例です。青いラインは、SDRに野生型ワームの通常の用量依存性の応答を表します。 DAF - 16（mu86）は SDR -誘導寿命の延長には何の影響もないまま、赤いラインは、SDRの寿命の効果が部分的にDRR - 2 OEによって抑制されていることを示します。 Cで寿命の解析を行うための詳細の方法虫は ^1-3以前の文献に記載されている。

図1 E.の推定のための検量線の代表結果大腸菌 OP50濃度。 OP50濃度は、測定OD ₆₀₀値の関数としてプロットされます。エラーバー= SD泊細菌の培養は、cfuの測定前に1,000 ×倍の吸光度測定の前に8倍、16倍、32倍、1.5倍2倍、4倍希釈し、そしてさらに希釈した。

図2：C.の代表結果虫の寿命実験では、SDRへの応答の異なる2つの変異体（緑と赤）（チンらから図^4）と野生型のN2の動物（青）を比較。エラーバーは= SEM

ディスカッション

食事制限（DR）が寿命を増やすおよび^5-7哺乳類を含む種の広い範囲で様々な加齢に伴う病気の発症を遅らせることが知られている。両方の環境と遺伝子操作は、CのモデルDRに使用されている半定義された液体培地^8,9、液体培地^10-12で細菌の食物源の希釈、およびより遅い速度¹³で送り、その動作の変異体の使用で培養型ワームなど、 エレガンス、。液体培地で培養するワームはほとんどのワームの研究室で適合した固体培地プレートの条件とは異なる成長条件を伴うのに対し、しかし、DRの遺伝的模倣は、DRに関係のない表現型を生成することがあります。標準的な固体プレート上で実行されたDRのプロトコルが有用になるため^{、4,14,15、}いくつかのグループによって開発されました。

ここで記述されたプロトコルでは、細菌は食物摂取のレベルを制御する方法として、プレートに二つの異なる抗生物質を適用することによって殺される。しかし、このようなUVの暴露のような代替方法は、細菌の増...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
カルベニシリン	Duchefa Biochemie	C0109.25	水に溶解。
カナマイシン	ロッシュ	10106801001	水に溶解。
バクトペプトン	ベクトンディッキンソン社	DF0118072
バクトトリプトン	ベクトンディッキンソン社	DF0123075
バクト酵母エキス	ベクトンディッキンソン社	DF0127071
寒天	ベクトンディッキンソン社	DF00145170
無菌培養管	米国サイエンティフィック	1485-0810
分光光度計	アマシャムバイオサイエンス	遺伝子クワントプロ	アマシャムは現在GEヘルスケアの一部です。
解剖顕微鏡	ツァイス	STEMI 2000
遠心	ベックマンコールター	Accuspin FR