卵巣と卵管の三次元器官培養用アルギン酸ゲル

サマリー

それらの三次元コンテキストで正常な細胞の培養は、細胞の形質転換および腫瘍形成に必要な初期の事象を研究するための代替メソッドを表します。このメソッドは、卵巣癌の形成の初期イベントを研究するために、通常の卵巣と卵管の細胞を成長させるために使用されます。

要約

卵巣がんは女性のがん死亡の第五の主要な原因であり、アメリカ¹位63％の死亡率を持っています。卵巣癌の起源の細胞型は、質問のままですし、どちらか卵巣表層上皮（OSE）または卵管の線毛^2,3の先端部上皮かもしれません。 in vitroでの初代培養のような正常細胞の培養は、科学者はそれによって決定的に起源の細胞型を決定する、明確な上皮で卵巣癌につながる可能性のある特定の変更をモデル化することが可能になります。これはこの病気を対象としたより正確なバイオマーカー、組織特異的遺伝子の変化と動物モデル、そしてより良い予防戦略の開発が可能になります。

アルギン酸ヒドロゲルの正常な細胞を維持することは、その三次元のコンテキスト内で細胞の体外培養において短期を促進し、プラスミドDNA、siRNAを、そして小分子の導入を可能にする。単一の臓器からメス、複数の文化を使って戦略的なカットから派生している部分での培養臓器によっては、単一の動物からの実験の数を増やし、生成することができます。これらは、卵巣癌の形成に関連付けられているOSEの増殖につながる排卵のモデルの側面をカットします。このようなプラスチックの表面にも成長していないOSEなどの細胞型は、この方法を用いて培養し、正常な細胞プロセスまたは癌の形成⁴の初期のイベントに調査を容易にすることができます。

アルギン酸ヒドロゲルは、組織の⁵の多くの種類の成長をサポートするために使用することができます。アルギン酸は、損傷組織^6,7をしない穏やかなゲル化作用で、その結果、β- D -マンヌロン酸とカルシウムイオンで ​​架橋することができるα- L -グルロン酸の繰り返し単位から成る線状多糖類である。このようなマトリゲルなどの他の三次元細胞培養マトリックスのように、アルギン酸は、組織のための機械的なサポートを提供しますが、タンパク質はアルギン酸マトリックスと反応しないため、セルが^5をシグナリング開始しない合成細胞外マトリックスとしてアルギン酸機能。アルギン酸ハイドロゲルは、標準的な細胞培養培地中に浮遊してin vitroでの組織の成長のアーキテクチャをサポートしています。

方法は準備、分離、および最大2週間の培養で維持することができるアルギン酸ヒドロゲル、に卵巣と卵管臓器片の埋め込みのために提示されます。器官培養からタンパク質とRNAサンプルの分析のための細胞の酵素放出についても説明します。最後に、主要な細胞型の成長は、マウスからの遺伝的不死化することなく可能であり、ノックアウトやトランスジェニックマウスを使用するために捜査官を許可します。

プロトコル

1。卵巣解剖と組織の分離

1. アルギン酸ナトリウムの0.5％（w / v）の溶液を調製、プロトコールの修正版から準備滅菌PBS、37への熱℃を使用して、これまで⁵に記載反転またはロッキングによるミックスが、ボルテックスしないでください。 25 Gの針を1mlのシリンジにアルギン酸を描画し、37℃に維持
2. 架橋組織のカプセル化時にアルギン酸および37に暖かい℃で10mMの無菌CaCl ₂溶液を準備
3. 各実験のための24ウェルプレートにウェル当たりの培地1mLの（αMEM+ 5単位ペニシリン、5μg/ mlのストレプトマイシン）を準備する。種々の薬物、ペプチド、または培養液中のウイルスが含まれています。前の臓器のカプセル化にトランスフェクションのために、37℃で4時間のリポフェクトアミン2000とプラスミドDNAと組織をインキュベート
4. 動物から臓器を解剖し、任意の脂肪や残存組織を除去する、軽く卵巣周囲の嚢の膜をやってのける、とオルガンを二分することによって4つの部分に卵巣や卵管をカット。動物を頸部脱臼に続いてCO ₂窒息により安楽死させた。卵管の場合は、軽く結ぶ膜を離れて引っ張り、切断する前にピンセットを使用して反対方向にチューブの端を拡張することによって組織を解く。
5. 滅菌メッシュ繊維の上に単一のアルギン酸の液滴（〜1月3日μL）を置きます。
6. 滅菌ピンセットを使用して、アルギン酸の液滴と中央に鉗子を用いて液滴または無菌の注射針を臓器の一部を移動する。
7. 滅菌ピンセットでメッシュの繊維を把握し、重力のハンギングドロップにアルギン酸を強制的に許可するように上下逆さまにそれを回して、臓器の一部（オルガノイド）を含む液滴を反転。
8. ドロップは、溶液中に入るように10mMのCaCl ₂溶液を含む10cmのペトリ皿の端に鉗子をタップします。
9. 2分間インキュベートし、培地中に余分な10mMのCaCl _2で 、転送を解放するために毛穴を含有する滅菌スプーンで取り除く。最大4つのアルギン酸ゲルへの培地を含む24ウェルプレートの1ウェルに移すことができます。定義された期間のための文化。

2。細胞のアルギン酸とコレクションの劣化

1. アルギン酸ゲルの可溶化のために、リーボビッツのL - 15 37メディア℃で30分間またはゲルが完全に溶解するまで、Cに溶解したアルギン酸リアーゼの文化（3.4 mg / mL）をインキュベートする。
2. アルギン酸リアーゼから組織を削除します。
3. OSEのコレクションの場合、1時間⁸リーボビッツのL - 15メディアにおけるコラゲナーゼの500台とオルガノイドをインキュベートする。 1分1秒パルス（1秒間ボルテックスし、1秒休息）に続いて1分間ミディアムパワーで2秒のパルス（2秒ボルテックスし、2秒休息）、の渦。臓器片はマイクロ遠心チューブと新しい滅菌マイクロ遠心チューブに上清をピペットの底に落としてください。ペレットの卵巣の表面上皮に3000 rpmで3分間遠心操作する。
4. 卵管上皮のコレクションの場合、5単位のペニシリン、5μg/ mlのストレプトマイシン、4％（v / v）のFBSを含むDMEM中で組織培養プラスチック上縦チューブをカットし、場所。 3-5日にわたり、細胞は卵管間質から"クロール"し、組織培養plastic9に成長する。

3。パラフィン切片用アルギン酸カプセル化された器官培養の固定

1. 選択した時点で培養液からビーズをカプセル化アルギン酸を収集する。
2. 2分間滅菌した10mMのCaCl ₂溶液中に文化をドロップすることによってゲルを堅くするアルギン酸をRecrosslink。
3. ゲルは固体のまま、完全に固定の間組織をカプセル化することを確実に50 mMスクロース、10mMのCaCl ₂及び50mMのカコジル酸ナトリウムを含有する2％パラホルムアルデヒドでアルギン酸カプセル化された臓器を修正。
4. 組織の処理に続いて、5μmのセクションを生成するためにミクロトームでパラフィンやセクションに全体のアルギン酸でカプセル化された器官培養片を埋め込みます。
5. アルギン酸塩を溶解し、ベースの抗原の検索を加熱するため、免疫組織化学を実行する場合は、スライドから削除されます。アルギン酸塩が残っていると立ってヘマトキシリン​​とエオシン染色でエオジンのために染色される。

4。代表的な結果：

卵巣と卵管の三次元器官培養の例を図1に示されています。卵巣は、異なる大きさの片に切断し、OSEは増殖し、メスで切開から負傷した表面を修復するために移行することができます。このプロセス中に、基盤となる間質に対する相対OSEの正しい向きは、卵巣をカプセル化しているOSEで、維持されます。図2に示すように、四半期またはeighthsにカット卵巣に比べて、半分にカット卵巣のOSEは、より完全に卵巣をカプセル化します。卵巣の傷の修復表面は全体の卵巣の文脈で検討することができ、排卵と表面修復が卵巣の表面の変形を誘導する方法に光を当てることができる。

実験のエンドポイントが必要とされる情報によって異なります。組織構造、細胞形態、および特定の細胞の成長率は、簡単にパラフィン切片を使用して監視されます。 7日間、5μg/ mlのインスリンの添加が、卵巣の表面上皮との複数の層の形成の過剰増殖を誘導しながら例えば、卵巣の表面上皮の単層は、7日間（図3A）の無血清αMEMで培養後に観察され細胞（図3B）。固定前に10μMの24時間の最終濃度で培養物にブロモデオキシウリジンを追加することによって、細胞の増殖は（挿入図3Aおよび3B）を測定することができます。顆粒膜細胞の割合が大きく、増殖しながら、無血清αMEMで維持培養のため、OSEの約3〜5％が、24時間の標識期間（挿入図3A）の間に増殖を受ける。培地にインスリンを添加すると、合計OSE（挿入図3B）の約30％にOSEを増殖の割合が高くなります。緑色蛍光タンパク質（GFP）の免疫蛍光は、cDNAをトランスフェクション（図3C）は、次の標準的な顕微鏡とアルギン酸ゲルを介して可視化することができます。アルギン酸の器官培養では卵巣の表面上皮と一次卵胞の成長と分析のために提供していますが、それは成熟した、二次卵胞は、この培養系（図3D）で生き残るために失敗することに留意すべきである。アルギン酸ハイドロゲルマトリックス内に満期までの個々の卵胞の培養は、他の場所で¹⁰記載されている。

タンパク質やRNAの変化は、全体の臓器または酵素的分解（図4）を使用して特定の細胞型から分析することができます。一部の間質細胞はまた、（図4D）絶縁されているものの、コラゲナーゼと培養卵巣オルガノイドの治療は、ペレットは、以下の処置を得られた細胞のOSEの濃縮を可能にしながら（図4C）無傷の基本的な間質を残します。

負傷後のOSEを伝播するために使用される図1。マウスの卵巣三次元培養システム。 A）顕微鏡下では、嚢と周囲の脂肪パッドは削除されました。 B）はそのまま卵管チューブと卵巣（O）（T）と脂肪パッド（F）。 C）ブルサと脂肪パッドで卵巣を除去（左）と巻かれていない卵（右）。 D）卵巣や卵管オルガノイドは、アルギン酸の液滴に入れた。 E）アルギン酸包まオルガノイドは、CaCl ₂溶液に架橋ゲルを形成するために、アルギン酸塩に滴下した。 F）アルギン酸カプセル化された卵巣オルガノイドは。 G）アルギン酸は、卵管オルガノイドをカプセル化。 H）アルギン酸カプセルオルガノイドは、培養培地中でインキュベートした。

図2表面領域は、サイトケラチン8によって測定された卵巣の表面が再生成されます。 eighths、四半期、半分にカットされた後、OSEによる卵巣オルガノイドのカプセル化は、BSA培地で培養し、サイトケラチン8（CK8）抗体を用いた免疫組織化学分析により測定。

図3。アルギン酸の培養系は、成長因子の通過とOSEへのcDNAのトランスフェクションすることができますが、卵胞の急速な成長と成熟を ​​サポートしていません。 A）卵巣オルガノイドは、OSEをマークCK8表現、について分析した基礎培地で7日間培養。はめ込み、シリアルセクションでは、BrdUの取り込みのために染色。 B）培地にインスリンの添加は、OSEの過形成を誘導する。はめ込み、シリアルセクションでは、BrdUの取り込みのために染色。 C）卵巣オルガノイドは、GFPを発現するようにするcDNAでトランスフェクション。 D）アルギン酸の培養系は、原始卵胞（赤矢印）の成長をサポートしますが、成熟していない二次卵胞（黒矢印）。

図4。OSEは、培養後分析のために単離することができる。 A）オルガノイドは最大2週間のための培地で培養する。 B）カプセル化オルガノイドは、オルガノイドをそのままにしておくアルギン酸リアーゼと扱われます。卵巣は、OSEをマークするCK8で染色される。 C）オルガノイドは、基礎となる間質からOSEを分離するコラゲナーゼで処理される。残りの組織片は、卵巣表面の除去を強調するためにCK8で染色した。 CK8（赤）を染色としてD）処理後に回収した細胞は、OSEのために濃縮されます。細胞は核をマークするためにDAPIで対比されています。

ディスカッション

アルギン酸ハイドロゲルを利用した三次元器官培養系の開発は、生物の多種多様な多くの異なる組織型を分析するための汎用的な方法を表します。それは細胞が^11を成長することのできる足場を提供するので、3次元培養の使用は、組織工学と再生医療の分野に拡張することができます。現在、私たちの研究室ではヒト卵巣と卵管組織を用いた初期の研究が行われているが、ヒトおよび非ヒト霊長類卵胞の培養は^、12,13に記載されている。

文化のオルガノイドにアルギン酸ハイドロゲルの使用は、それらの取り入れコラーゲン、フィブリン、またはヒアルロン酸のようなハイドロゲルの他のタイプに比べていくつかの利点を、提供しています。室温、中性pHでのアルギン酸塩ゲル、ゲルがオルガノイド¹⁴カプセルとして組織するために少し混乱を提供する。アルギン酸は、組織の成長の⁵の化学的に不活性なサポートを提供し、細胞タンパク質とは反応しない。ゲルは培養細胞¹⁵の検索を可能にする、カプセル化された組織を分解しない酵素的に分解用いたアルギン酸...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
リーボビッツL - 15培地	ギブコ	11415
αMEM培地	ギブコ	12000-022
アルギン酸ナトリウム	Novamatrix
カコジル酸ナトリウム	シグマアルドリッチ	C0250
ポリプロピレンメッシュ繊維	マクマスターカー		45"ワイドロール、0.0041"オープニング
リポフェクタミン2000	インビトロジェン	11668
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15070-063
アルギン酸リアーゼ	シグマアルドリッチ	A1603
A1603	シグマアルドリッチ	C9697	クロストリジウムヒストリから
ウシ血清アルブミン	MPのバイオメディカル	103700
ウシ胎仔血清	ギブコ	ギブコ
ITSソリューション	ロッシュ	11074547001	インスリン/トランスフェリン/亜セレン酸ナトリウム
サイトケラチン8抗体	発達研究ハイブリドーマバンク	TROMA - 1	1:200で使用
DAPI	ベクトル研究所	H1200
ブロモデオキシウリジン	シグマ	B50002 - 1G	最終濃度10μM