レプトスピラタンパク質の表面露出を評価するために効率的な方法が記載されている。方法は、特にレプトスピラ細胞の脆弱な外膜の崩壊を回避するために設計されています。この手法にはいくつかのネガティブコントロールの雇用は、外膜と抗体反応の特異性の整合性を評価する必要があります。
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この記事について
サマリー
要約
細菌の表面タンパク質は、宿主細胞と直接接触し、環境1からの栄養素の摂取に関与している。このような理由から、細胞内局在は、細菌タンパク質の機能的役割についての洞察を提供することができます。細菌タンパク質の表面の局在は、病原性のメカニズムに関与病原因子の同定に向けた重要なステップです。
レプトスピラ膜2-5を分画するための方法はそのようなリポタンパク質対貫通OMPSとして外膜タンパク質（OMPS）、特定のクラスに対して選択的であるため、誤分類する可能性があります。この可能性は、構造的な違いと、それらがどのように外膜に関連付けられているためです。リポタンパク質はN末端 脂質部分（3つの脂肪酸）と脂質二重層のリン脂質6,7の間に疎水性相互作用を介して膜に関連付けられています。対照的に、膜貫通OMPSは通常、樽状の構造8,9に配置されたβ-シートの両親媒性で脂質二重層に組み込まれています。さらに、外膜のタンパク質の存在は、必ずしも蛋白質またはそのドメインが表面に露出していることを保証するものではありません。スピロヘータ外側の膜は壊れやすくなるため、サブ表面のタンパク質の細胞とインクルージョンの穏やかな操作を含む方法を必要とすることが知られている外膜の完全性を評価するために制御します。
ここで、我々が直接そのままレプトスピラ上のタンパク質の表面の露出を評価するために蛍光抗体法（IFA）法を提案する。この方法は、抗原特異的抗体によるレプトスピラ表面タンパク質の認識に基づいています。ここで、OmpL54 10の特異的な抗体は、ネイティブ、表面露出エピトープにaftero結合detetctedされています。無傷対透過性細胞への抗体の反応性の比較は、細胞分布の評価を可能にし、蛋白質は、レプトスピラ表面上に選択的に存在するかどうか。外膜の完全性、好ましくは、ペリプラズムに位置する1つまたは複数の地下タンパク質、抗体を用いて評価すべきである。
表面IFA法は、特異的抗体が利用可能な任意のレプトスピラタンパク質の表面の露出を分析するために使用することができます。法の有用性と限界の両方が採用さ抗体がネイティブエピトープに結合することができるかどうかによって異なります。抗体はしばしば組換えタンパク質、天然のエピトープに対して提起されているので、表面に露出したタンパク質が認識されない場合があります。それにもかかわらず、表面IFA法は無傷細菌の表面の成分を研究するための貴重なツールです。この方法は、レプトスピラだけでなく、他のスピロヘータとグラム陰性菌に対してだけでなく、適用することができます。 OMPSの表面露出に関する強力な結論のために、いくつかの細胞の局在の方法を含む包括的なアプローチは、10をお勧めします。
プロトコル
1。スライドガラスへのレプトスピラの固定
- レプトスピラinterrogansはクラスBSL2病原体です。生細胞での作業には、手袋、実験室、コートと無菌フードのピペッティング操作などの適切な取り扱いが必要です。
- 30 ° Cに到達するまで半ばまで約6日間の後期対数増殖期（5 × 10 8細胞/ mlに5 × 10 7の密度）。で、1％ウサギ血清を補充した、EMJH medium11でレプトスピラを拡大
- 室温で7分間〜2000 × gで遠心分離によって培養を回収する。
- 吸引により上清を除去し、穏やかにリン酸塩でペレットを再懸濁さは5 × 10 8細胞/ mlの最終濃度にのMgCl 2、pH7.2生理食塩水（PBS）-5 mMのバッファ付き。
- 二ウェルチャンバースライドガラスの各ウェルに細胞懸濁液1 mlを加え、30℃でインキュベート℃を80分間、細胞が付着できるようにする。
- 慎重に吸引して未結合の細胞を含む液体を取り除く。
- PBS - 5 mMのMgCl 2の2％パラホルムアルデヒドを1ml /ウェルを添加することによりガラススライドに、残りの無傷の細菌を修正。 30℃で40分間インキュベート℃にこれらのスライドは、表面に露出したタンパク質の評価になります。
- サブ....
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ディスカッション
私達の表面IFA技術は、様々なborrelial 15、16、レプトスピラ12、17のタンパク質の表面の露出を示すために使用されているものと似ています。ここで説明する表面IFAの方法の詳細は、スライドガラスに付着しレプトスピラ細胞の傾向を利用しながら外膜の完全性を維持する目的で、細胞の操作を最小限に抑えるように設計されています。方法は、外膜安定化バッファー（PBS 5 mMのMgCl 2）、すでに公開されているプロトコル12、17より少ない洗浄ステップで洗浄、パラホルムアルデヒドの低濃度（4％対2％）が含まれます。さらに、私達の表面IFA法は、正確なデータの解釈に不可欠な、コントロールの重要性を強調している。方法の制限は、目的のタンパク質の表面に露出したエピトープを認識することが可能な特異的抗体の可用性を必要とすることである。場合によっては、他の表面タンパク質またはリポ多糖による立体障害は、抗体 - 抗原の形成を防ぐことができます。それにもかかわらず、表面IFA法は、直接タンパク質の表面の露出を評価するための比較的簡単なテクニックで、スタンドアロンの.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この研究は、公衆衛生サービス助成金AI - 34431（DAHに）アレルギーと国立感染症研究所からとVA医学研究基金（DAHに）によっても支持された。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（省略可能） |
| 二つウェルチャンバースライドガラス | ラボテック | 177380 | |
| ウサギ血清 | ロックランドのImmunochemicals | D209 - 00から0100 | |
| レプトスピラ濃縮EMJH | BD Difco社 | 279510 | |
| のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG（H + L） | Invitrogen社/ Molecular Probes社 | - 11034 | |
| のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG（H + L） | Invitrogen社/ Molecular Probes社 | - 11029 | |
| 4'6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール二塩酸塩（DAPI） | Invitrogen社/ Molecular Probes社 | D1306 | |
| ゴールドアンチフェードマウンティングメディウムを延長 | Invitrogen社/ Molecular Probes社 | P36930 | 使用前に室温に平衡化 |
| Fisherfinestプレミアムカバーガラス | フィッシャー | 12-544-14 | |
| 蛍光顕微鏡 | ツァイス | Axioskop 40 |
参考文献
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. In....
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再版と許可
