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CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

DOI:

10.3791/2809

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August 5th, 2011

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1Department of Pediatrics and Department of Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。

Abstract

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赤血球生成の研究は、以前の造血および赤芽球前駆細胞から形成される方法を赤血球を理解することを目指しています。具体的には、赤血球の形成の速度は、その合成組織低酸素によって引き起こされるホルモンのエリスロポエチン（EPO）、によって制御されている。エポの急速な増加に適切な組織の酸素化の結果、赤芽球率の増加を駆動への脅威、赤芽球ストレス応答と呼ばれるプロセス。循環赤血球数の結果の増加は、組織の酸素運搬を改善します。効率的な赤血球産生のストレス反応は、それゆえ生存とそのような高高度、貧血、出血、化学療法または幹細胞移植などの生理学的および病理学的状態からの回復に重要です。

マウスは、赤血球とそのストレス応答の研究のための重要なモデルです。マウス決定的な（成人型）赤血球産生が新生児脾臓で、そして成人の脾臓および骨髄で、胚日12.5と15.5の間に胎児の肝臓で行われます。組織内の赤血球前駆細胞を識別するための古典的な方法は、EPOを含む半固体培地に播種すると、赤色の細胞コロニーを生じさせるために、これらの細胞の能力に依存しています。彼らの赤血球前駆子孫は、形態学的基準に基づいて識別されます。どちらもこれらの古典的な方法のは、分子研究のための分化段階特異的赤血球系細胞の多数へのアクセスを許可しません。ここでは、直接、新たに分離したマウスの組織のコンテキスト内で分化段階特異的赤血球前駆細胞と前駆体を、識別し、勉強のフローサイトメトリー法を提示する。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119上、およびセルサイズの関数であるフローサイトメトリー"前方散乱"パラメータに依存しています。 CD71/Ter119アッセイは低酸素の条件に収容された貧血マウスまたはマウスでは、例えば、in vivoでのエリスロポエチンストレスへの応答中に赤芽球前駆細胞を研究するために使用することができます。また、赤血球内の変更された分子経路の特定の役割を評価するために、遺伝子組み換え成体マウスや胚の組織に直接赤血球前駆細胞を研究するために使用されることがあります。

Protocol

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1。組織の収穫

  1. （0.2％BSA及び5mMのグルコースを付加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS））2〜5ミリリットル冷染色バッファーを含むチューブを準備します。前の組織の収穫にチューブを氷中に保管してください。
  2. カリングマウス適切な承認のプロトコルに従って（例えば、CO 2吸入頸椎脱臼が続く）。
  3. 後で分析、ヘマトクリット値の例、網状赤血球数またはCBC分析のためにEDTAまたはヘパリン血液コレクションチューブに心臓穿刺により血液を描く。
  4. ステップ1で調製した別のチューブにそれぞれのマウスから採取した組織を置くこと、脾臓、骨を収穫。脾臓への容易なアクセスは、左側からです。骨髄、収穫一方または両方の大腿骨用。氷の上で収穫した組織をしてください。
  5. 必要に応じて、脾臓の重量を量る。エリスロポエチンストレス応答を受けているマウスは、脾臓重量の有意な増加を示す可能性があります。

2。脾臓細胞の調製

  1. ウェットタイプの3ミリリットルシリンジプランジャを使用して、ゆっくりと40μmの滅菌セルストレーナー（Fisherbrandカタログ番号22363547またはその他）を介して脾臓、または脾臓の一部を（理想的に、0.1グラム以下、約10 8細胞に相当）をプッシュ50 mlコニカルチューブの上に配置。この手順の実行中にチューブを氷上....

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Discussion

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フローサイトメトリーの方法論は、リン酸化特異的抗体3と細胞周期の状態を用いて細胞表面マーカー、タンパク質発現、細胞生存、細胞内シグナル伝達を含む、蛍光標識特異的抗体またはリガンド、と検出されても細胞機能の同時調査が可能になります。これらの測定は、新たに単離した赤血球生成組織のコンテキストで、分化段階の特定のサブセットの数の各々に行うことができる。このメソッドは、したがって、エリスロポエチン刺激の広い範囲への対応として、あるいは遺伝的変異の結果として、赤芽球系の様々なレベルでの機能と分子の変化を評価することができます。

いいえ抗体が交差反応することなくはない、との交差反応性は、組織に特化したものがあります。それは、nullまたはノックダウン細胞モデルのいずれかを使用して、、さらに以前にテストした抗体のために、赤血球生成組織の文脈におけるその特異性を確認することが重要である。

特定の赤芽球サブセットの細胞は、RNAまたはトランスクリプトーム解析のためにソートすることができる。ソートの実験は、細胞のせん断応力を.......

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Disclosures

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動物実験は、マサチューセッツ大学医学部IACUC委員会の大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

Acknowledgements

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リチャードKonz、テッドGiehl、バーバラGosselinは、月華区とタミーKrupoch：我々は、ユーマスフローサイトメトリーコアに感謝。この作品は、NIH / NHLBI RO1 HL084168（MS）およびNIH CA T32 - 130807（JRS）によって賄われていた。糖尿病内分泌学研究センター助成金DK32520でサポートされているコアのリソースも使用した。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名前会社カタログ番号
FAS -ビオチン BD Pharmingen社 554256
ストレプトアビジン- APC 分子プローブ S868
40μmの滅菌セルストレーナー Fisherbrand 22363547
FACS染色のためのポリスチレン丸底チューブ BDファルコン 352008
U底96ウェルプレート BDファルコン 353910
ChromePureウサギIgG ジャクソンイムノ 015-000-003
CD71 - FITC（株0.5mg/ml） BD -バイオサイエンス 553266
TER119 - PE（株0.2mg/ml） BD -バイオサイエンス 553673
7AAD BD -バイオサイエンス 559925
DAPI粉ロッシュ 236276
FITCのラット抗マウスCD41 MWReg30 BD Pharmingen社 553848
FITCラット抗マウスCD45R/B220 RA3 - 6B2 BD Pharmingen社 553087
FITCのラット抗マウスCD411b/Mac-1 M1/70 BD Pharmingen社 557396
FITCラット抗マウスのLy - 6GとLy - 6C（GR - 1）RB6 - 8C5 BD Pharmingen社 553126
FITCハムスター抗マウスCD3e 145 - 2C11 BD Pharmingen社 553061
APCのBrdUフローキット BD Pharmingen社 557892
アネキシンV -ビオチン BD Pharmingen社 556418

References

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  1. Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
  2. Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesi....

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CD71 TER119 AssayFlow Cytometry AnalysisErythroid Progenitor IdentificationMouse Erythropoiesis StudyCell Surface MarkersForward Scatter ParameterFetal Liver IsolationBone Marrow HarvestErythroblast Maturation StagesErythropoietic Stress Response

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