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方法論記事

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で赤血球

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DOI:

10.3791/2813

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2011年7月16日

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

この記事について

サマリー

アン生体外でプロトコルが記述されている造血幹/前駆細胞から成熟ヒト赤血球を生成する。さらに我々は、ノックダウン一次赤血球系細胞における転写因子のTAL1をするために効率的なレンチウイルスの配信方法を説明します。レンチウイルスによる遺伝子導入効率はGFP発現ウイルスを用いて示されています。

要約

赤血球は細胞の分化を研究するために一般的に使用されるモデルシステムです。赤血球中に、多能性成体ヒト造血幹細胞（HSC）はoligopotent前駆細胞、コミットされた前駆体および成熟赤血球1に分化する。このプロセスは、付随して他の細胞タイプ2に固有の遺伝子を抑制する一方、特定の転写因子は、系統特異的遺伝子を活性化により、遺伝子発現のレベルでの大部分は規制されています。赤血球産生を制御する転写因子に関する研究は多くの場合、赤血球細胞が分化3-5の特定の段階で、ある程度、表現するヒトおよびマウス細胞株を使用して実行されます。しかし、形質転換細胞株は、部分的にしか赤血球系細胞を模倣することができますし、最も重要な、彼らは1つが理解しやすく、最終的な赤血球の運命に向かって多くの段階を経て細胞の進捗状況として発生する動的な変化を研究することはできません。したがって、現在の課題は、ゲノミクスおよびプロテオミクスの実験を行うのに十分な量で分化の様々な段階での主造血幹細胞と赤血球細胞の比較的均質な集団を得るために、プロトコルの開発のまま。

ここでは、臍帯血、骨髄、またはG - CSF（白血球搬出）を動員成人末梢血のいずれかから単離されたヒト造血幹/前駆細胞から赤血球分化を誘導するためにex vivoでの細胞培養のプロトコルについて説明します。最初にDouay研究所6によって開発されたこの培養系は、、骨髄の微小環境を模倣する間葉系細胞にサイトカインと共培養を使用しています。このex vivoの分化のプロトコルを使用して、我々は、赤血球前駆細胞の強力な増幅、排他的に赤血球系統と除核赤血球のステージへの完全な成熟に向かって分化誘導を観察。したがって、このシステムは、赤血球の系統に沿って造血幹細胞の進行など、転写制御の分子機構を研究する機会を提供しています。

転写レベルでの赤血球産生を研究することも主要な赤血球系細胞で過剰発現やノックダウン、特定の要因に能力を必要とします。この目的のために、我々は7分割し、非分裂細胞の両方を効率的に感染を可能にするレンチウイルスを介した遺伝子送達系を使用してください。ここで我々は効率的に初代ヒト赤血球系細胞における転写因子のTAL1をノックダウンすることができることを示している。さらに、GFPの発現は90％近くにレンチウイルス感染効率を示しています。従って、我々のプロトコルは、制御赤血球その転写因子の調節ネットワークの特性評価のための非常に有用なシステムを提供します。

プロトコル

パートI. ヒト造血幹・前駆細胞のex vivo赤血球造血

1. ヒトCD34+造血幹/前駆細胞の単離

造血幹細胞（HSC）と初期前駆細胞の混合物を含むヒトCD34+細胞集団8を、臍帯血、G-CSFで動員した末梢血（白血球アフェレーシス）、または骨髄から採取します（図1-ステップ1）。臍帯血または末梢血を使用する場合は、ステップ1.2へ進んでください。骨髄を使用する場合は、ステップ1.1から開始してください。試薬および器具については、表1をご参照ください。

特に指示がない限り、この手順は無菌状態（例：クリーンベンチ内）かつ室温（RT）で実施します。

  1. 骨髄の単細胞懸濁液の調製：
    1. 0.02% コラゲナーゼBおよび100 U/ml DNase 1を含むRPMI 1640を10倍量加え、骨髄を再懸濁する。
    2. バランスシェーカーを用いて45分間、穏やかに混合する。
    3. 細胞を30μmのナイロンメッシュでろ過する。
  2. Ficoll密度勾配遠心法により、低密度単核細胞（MNC）を分離します。
    1. 血液または骨髄懸濁液を、2%胎児牛血清（FBS）および2mM EDTAを含むPBSで2〜4倍量に希釈する。 注：液量を増やすことで、単核細胞（MNC）の純度を高めることができる。
    2. 50 mlコニカルチューブに、15 mlのFicoll-paqueの上に35 mlの希釈細胞懸濁液を慎重に層状に重ねる。スイングバケットローターを用い、ブレーキなしで400gにて30分間遠心分離する。
    3. 中間層のMNC層を乱さないように、上層を吸引してください。
    4. （MNCsを含む）界面層を、新しい50 mlコニカルチューブに移す。
    5. 2% FBSおよび2 mM EDTAを含むPBSをこのチューブに満たし、チューブを反転させて緩やかに混ぜた後、室温で300gで10分間遠心分離する。上清を捨てる。
    6. 血小板を除去するため、細胞ペレットをさらに2回洗浄する。 注：このステップにより、CD34の純度が向上します。+ 細胞
    7. 20 μlの細胞懸濁液をとり、エッペンドルフチューブに入れる。200 μlの赤血球溶解バッファー（表1）を加え、室温で2分間インキュベートする。この懸濁液 18 μlを血球計数器に滴下し、有核単核細胞（MNC）をカウントする。
    8. MNCは、直ちに使用するか、または-10℃で凍結保存することができます。8 10% DMSOを含む細胞培養液に入れ、液体窒素で保存された細胞/ml。
  3. CD34の単離+ 陽性免疫磁気選択による細胞の回収（図1-ステップ1）
    CD34 Microbead Kit（マウス抗ヒトCD34モノクローナル抗体が結合したマイクロビーズ溶液およびヒトIgGを含むFcRブロッキング試薬溶液を含む）を、2本のLS Mini-Macsカラム、autoMACS Running Buffer、およびMiniMACS Separatorと組み合わせて使用します（表1）。以下に、$2.3 \times 10$から始まるプロトコルを記載します。8 単核細胞（MNCs）。異なる細胞数を使用する場合は、それに合わせて液量を増減させてください。さらに、最大2×108 MNCsの分離には、LS MiniMacsカラムの代わりにMS MiniMacsカラムを使用することができます。
    細胞表面での抗体のキャッピングおよび非特異的な細胞標識を防ぐため、細胞と試薬は冷所（4～8°C）で保持してください。
    1. 2.3x10^6個の細胞を含むペレットを再懸濁します。8 690 μlのランニングバッファー（10^8 MNCsあたり300 μl、最低懸濁液量として300 μlが必要）を用いてMNCsを懸濁し、15 mlコニカルチューブに移す。
    2. FcRブロッキング試薬を230 μl加える。
    3. CD34 MicroBeads溶液を230 μl添加する。
    4. 手動で十分に混合し、4°Cで30分間インキュベートする。
    5. 10 mlのRunning Bufferを加えて細胞を洗浄し、300gで10分間遠心分離する。
    6. 上清を完全に吸引してください。
    7. 細胞を1.2 mlのRunning Bufferで再懸濁する（10^7個あたりのバッファー使用量は0.5 mlとする）。8 単核細胞（MNCs） 注：磁気分離を行う前に、単一細胞懸濁液を得ることが重要である。必要に応じて、細胞を30μmのナイロンメッシュに通し、細胞の凝集塊を除去すること。
    8. MiniMACSセパレーターの磁場内にLSコラムを設置し、準備します。
    9. カラムを3 mlのランニングバッファーで洗浄します。
    10. 細胞懸濁液1.2 mlをカラムに適用する。
    11. フロースルーを回収し、それを用いてCD34の収量および純度を確認する。+ 細胞分離。あるいは、この画分に含まれる細胞を凍結し、液体窒素中に保存する。 注：この画分には未標識細胞が含まれており、一部の標識CD34が含まれている場合もあります。+ カラムに付着しなかった細胞。
    12. カラムを3 mlのランニングバッファーで3回洗浄し、その洗浄液を合わせて回収し、前述のフロスルー分画と同様に使用する。
    13. カラムをマグネットから外し、15 mlポリプロピレン製回収チューブに設置してください。
    14. 細胞を溶出させるため、カラムにRunning Bufferを5 ml加え、ラベル化されたCD34を直ちに洗い出します。+ プランジャーをカラムに強く押し込み、細胞を詰め込みます。
    15. 新しく調製したLSカラムに細胞を通し、カラム精製の手順（ステップhからn）を繰り返します。 注：これにより、CD34の純度が高まります。+ 細胞。2.3x108 白血球アフェレシスから単離された単核細胞（MNC）から、通常1.1x106 CD34+ 純度の高い細胞 > 95±3%（図1-ステップ1）。
    16. 10% DMSOを含む培地中で細胞を凍結し、液体窒素で保存するか、あるいは直接ステップ2に進みます。

2. 細胞培養における赤血球系分化

CD34+細胞を、ヒドロコルチゾンおよび特定の組み合わせのサイトカインを逐次的に添加したサプリメント添加IMDM培地で、6から改変した4ステップのプロトコルに従って培養します（図1-ステップ2）。細胞の増殖および赤芽球分化を確認するため、手順全体を通じて一連の試験が行われます。

培養の開始に必要なCD34+細胞数は、実験の規模によって異なります。通常、遺伝子発現の研究では、10 mlの培地で0.1x106個のCD34+細胞を用いて小規模培養を行い、手順全体を通して余剰細胞を凍結保存することで少量の容量を維持します。タンパク質抽出が必要な研究では、より大規模な培養が行われます。ここでは、白血球アフェレーシスから単離した約7x106個のCD34+細胞から開始する大規模実験について説明します。
全工程で無菌状態を維持してください。試薬については表1、2、および3を参照してください。

  1. 試薬の調製
    1. 表2に従って添加剤を加えたIMDM培地を調製し、40 mlずつ分注して-20°Cで凍結保存する（この操作は事前に行うことが可能である）。
    2. 表3に記載されている通りに、ヒドロコルチゾンおよびサイトカインのストック溶液を調製する。
  2. ステップ1：0～11日目
    造血細胞は、ヒドロコルチゾン（HC）、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン3（IL-3）、およびエリスロポエチン（EPO）を添加したIMDM培地（表3）で培養する。ステップ2に備え、MS-5マウス骨髄基質細胞（表1）を増殖させておく。
    • 0日目：
      1. 添加物を加えたIMDM培地120 mlをあらかじめ温めておき、HC、SCF、IL-3およびEPOを添加する（表3）。
      2. 7x10を融解する6 CD34+ まず、バイアルを37°Cの恒温水槽に浸します。細胞が凍結した状態で、あらかじめ温めておいた培地1 mlを加え、細胞を15 mlコニカルチューブに移します。バイアルを2 mlの培地で洗浄し、その液を15 mlチューブに移します。
      3. 細胞懸濁液に6 mlの培地を加え、チューブを反転させて混合した後、200 gで5分間遠心分離する。
      4. 上清を吸引し、細胞ペレットを10 mlの新鮮な培地で再懸濁する。
      5. 10 μlの細胞懸濁液と10 μlのトリパンブルー溶液を混合し（表1）、ヘモサイトメーターを用いて生細胞数を計測する。 注：融解中の細胞死は約25%であるため、生存細胞の濃度は約0.5x10^6 cells/mLとなるはずです。6 個/ml
      6. テスト用に細胞懸濁液を約3 ml保存してください（パラグラフ6を参照）。
      7. 残りの7 mlをT-175フラスコに移し、培地63 mlを加えて0.05x10^6/cm²にします。6 70 mlにして、フラスコを37°Cのインキュベーターに入れる。
    • 1日目：
      1. 85 mlのMS-5細胞培養培地（Glutamax含有αMEM（表1）、10% FBS、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン）を予熱する。
      2. 150mm x 25mmの丸型培養皿を3枚用意し、それぞれに2x10^6個の細胞を播種する。6 0.08x10^6個のMS-5細胞を得るため、25 mlの培地中に調製する6 個/mLとし、37°Cのインキュベーターに入れる。 注：低継代の（<20) MS-5細胞。コンフルエントに達した培養細胞は、0.05% EDTA含有トリプシンを用いて3日ごとに1:5の比率で継代し、拡大培養を行う。
    • 2日目：
      1. トリパンブルーを用いて造血細胞を計数して死細胞を除外したあと、試験に必要な細胞（すなわち、培養液約20 ml）を回収する（段落6を参照）。 注：我々の経験では、最初の2日間で細胞死が30〜50%を超える可能性があり、そのため最終的な細胞濃度は通常、0日目の濃度に近い値になります（図2）。
      2. MS-5培地を25 mlの新鮮な培地で交換し、その際、接着しなかったMS-5細胞が除去されるようにしてください。
    • 4日目：
      1. トリパンブルーを用いて造血細胞を計数して死細胞を除外し、試験に必要な細胞（すなわち、約10 mlの培養液）を回収する（段落6を参照）。 注：この時点で、細胞は〜を用いて増殖し始めているはずである。 >生細胞の75%、濃度は約0.2x106 細胞/mL。細胞は1-2x10^6の密度で凍結させることができます。6 10% DMSOを含む補充IMDM培地中で10^6 cells/mlとし、液体窒素で保存する。
      2. 残りの培養液約40 mlをT-175フラスコに移し、最終容量が150 mlになるまで、HC、SCF、IL-3、およびEPOを添加した補充済みIMDM培地（表3）を加える。 注：細胞濃度は約0.05x10である必要があります。6 個/ml
      3. MS-5細胞（コンフルエンス60-70%であること）を、0.05% EDTA含有トリプシンを用いて、新しい150mm x 25mmのラウンド培養ディッシュに1:5の比率で希釈して拡大培養する。最終的な細胞濃度は〜0.08x10⁶/mLとする。6 個/ml 注：通常、1枚のディッシュを5倍に拡大できるため、約0.08x10⁶個のMS-5細胞を含むディッシュを15枚用意してください。6 個/ml
    • 6日目：
      1. トリパンブルーを用いて造血細胞を計数して死細胞を除外した上で、試験に必要な細胞数（例：培養液〜5 ml）を回収する（段落6を参照）。 注：細胞は高度に増殖している段階にあるため、細胞濃度を1.5x10⁶以下に維持してください。6 cell/ml。細胞濃度が高い場合は、HC、SCF、IL-3、およびEPOを添加した新鮮な補完IMDM培地を加えてください。
    • 7日目：
      1. トリパンブルーを用いて造血細胞を計数し、死細胞を除外する。 注：当面の経験では、細胞は通常1.5x10の密度に達します。6 7日目の細胞数/ml。
      2. 細胞濃度を〜0.8x10に維持するために、十分な量の培地を加える。6 細胞/ml 注：通常、HC、SCF、IL-3、およびEPOを含む新鮮な補充済みIMDM培地を100 ml添加し、細胞濃度を約0.8x10[ exponents missing in source]として、全量を245 mlにします。6 細胞/ml
      3. トリプシン0.05% EDTAを用いて、MS-5細胞（コンフルエンス60〜70%のもの）をT-175フラスコ（ディッシュではなく）に1:5の割合で希釈し、拡大培養する。最終細胞濃度は〜0.08x10^6/mLとする。6 細胞/ml 注：約0.08x10^6個のMS-5細胞が入った61本のフラスコ6 cell/mlで調製してください。残りのMS-5細胞は凍結し、液体窒素中に保存します。
    • 8日目：
      1. トリパンブルーを用いて造血細胞をカウントして死細胞を除外し、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約5 ml分）を回収する（パラグラフ6を参照）。 注：細胞密度は〜1x10^6/mLにする必要があります。6 個/ml
      2. SCFおよびEPOのみを添加したサプリメント添加IMDM培地2Lを予熱する（表2および3）。
      3. 造血培養液200 ml（約200x10^6個の細胞を含む）を回収します。6 （細胞）、200 gで10分間遠心分離し、上清を吸い出した後、SCFおよびEPOを添加したIMDM培地40 mlで細胞ペレットを再懸濁する。
      4. 細胞懸濁液を8本のT-175フラスコに分配し（1本当たり5 ml）、それぞれのフラスコにSCFおよびEPOを添加したIMDM完全培地245 mlを加える。 注：現在、0.1x10の細胞を250 mlずつ含むフラスコが8本あります。6 細胞/ml
      5. 8日目に残っている細胞（約40ml）は、1-2x10^6 cells/vialの濃度で凍結保存することが可能です。6 10% DMSOを含む補充IMDM培地内で細胞/mlとし、液体窒素中で保存した。
    • 10日目：
      1. トリパンブルーを用いて造血細胞をカウントし、死細胞を除外した上で、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約5 ml分）を回収する（段落6を参照）。 注：細胞密度は〜1x10である必要があります。6 細胞/ml
  3. ステップ2：11～15日目
    細胞の約半分は、後で使用するため（例：核抽出など）に回収します。残りの赤血球系細胞は、EPOを含む補充済みIMDM培地を用いて、MS-5細胞上で共培養します（表2および3）。赤血球系細胞は、3〜4日ごとに新しいMS-5細胞層に継継代する必要があります。
    • 11日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤芽球を計数し、死細胞を除外する。 注：細胞密度は約1.5x10にしてください。6 細胞/ml
      2. 1xPBS 1L、添加物入りIMDM培地 400ml、およびEPO含有添加物入りIMDM培地 5L（表2および3）を37°Cで予熱しておく。
      3. 培養液を15x10相当の容量で確保する8 細胞（例：250 mlフラスコ約4本分）を用意し、手順eへ進む。
      4. 残りの細胞（例：15×10^6個）8）をコニカルチューブで回収し、450 gで10分間遠心分離した後、0.1mM DTTを含む冷MS30バッファー（表5）を用いて、最大10まで再懸濁する8 cell/mlとし、液体窒素で急速凍結後、将来的に使用（例：核抽出物）するため-80°Cで保存する。
      5. コンフルエントとなったMS-5細胞を含む50本のフラスコを、それぞれ20 mlの1xPBSで洗浄し、直ちにEPOを含む新鮮な補充済みIMDM培地80 mlを各フラスコに加える。 注：フラスコ数が多いため、一度に4本のフラスコを処理します。具体的には、コンフルエントになったMS-5細胞が入ったフラスコ4本をインキュベーターから取り出し、1xPBSで洗浄し、80 mlの培地を加えてから、フラスコをインキュベーターに戻します。すべてのフラスコを準備してインキュベーターに戻した後、ステップfに進みます。大規模な手順で処理するフラスコ数が多いため、これらのステップを2人同時に行うことが効率的です。
      6. 15x10に相当する量を遠心分離します。8 赤血球系細胞を4本のコニカルチューブに入れ、450 gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。
      7. 4つの細胞ペレットを、添加物を加えたIMDM培地100 mlずつで洗浄する。
      8. 各細胞ペレットを、EPOを含むサプリメント添加IMDM培地250 mlで再懸濁し、この細胞懸濁液を20 mlずつ、MS-5細胞と80 mlの培地が入った50本のフラスコそれぞれに分注する。 注：この段階で、0.3x10^6 cells/mlの赤芽球100mlを含む、MS-5細胞がコンフルエントに達したフラスコが50本用意されている必要があります。6 細胞/ml
      9. 残りの11本のMS-5細胞フラスコを、0.05% EDTA含有トリプシンを用いてT-175フラスコに1:5に希釈し、継代培養してください。最終細胞濃度は約0.08x10^6 cells/mLとします。6 細胞/ml 注：MS-5細胞（約0.08x10⁶個/フラスコ）55フラスコ6 cell/mlで調製してください。
    • 12日目：
      1. Trypan blueを用いて赤芽球を計数し、死細胞を除外して、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約4 ml）を回収する（段落6を参照）。 注：細胞密度は約0.6x10である必要があります。6 細胞数/ml
    • 14日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤芽球数をカウントして死細胞を除外し、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約3 ml）を回収する（パラグラフ6を参照）。 注：細胞密度は~0.9x10である必要があります。6 細胞/ml
  4. ステップ3：15～18日目
    一部の細胞は、将来の使用（核抽出など）のために回収します。残りの赤芽球系細胞を、サイトカインを添加しない補完IMDM培地を用いて、MS-5細胞上で共培養します。
    • 15日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤血球系細胞を計数し、死細胞を除外する。 注：細胞密度は約1x10にする必要があります。6 細胞/ml
      2. 1Lの1xPBSおよび5Lの添加物入りIMDM培地（表2）を37°Cで予め温めておく。
      3. 培養液の10倍量（10x10に相当する量）を分取して保存しておく。8 細胞（例：100 mlフラスコ約10本分）を用意し、手順eに進む。
      4. 残りの細胞（例：40x108）を回収し、後の工程で使用するために、0.1mM DTTを含む冷MS30バッファー（表5）に再懸濁する（ステップ2：11日目のd参照）。
      5. コンフルエントになったMS-5細胞が入った50本のフラスコを、それぞれ20 mlの1xPBSで洗浄し、直ちに各フラスコに80 mlの新鮮なサプリメント添加IMDM培地を加える。
      6. 10x10に相当する量を遠心分離する8 赤血球系細胞を4本のコニカルチューブに入れ、450 gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。
      7. 4つの細胞ペレットを、それぞれ100 mlの添加物入りIMDM培地で洗浄する。
      8. 各細胞ペレットを250 mlのサプリメント添加IMDM培地で再懸濁し、MS-5細胞と80 mlの培地を含む50本のフラスコそれぞれに、この細胞懸濁液を20 mlずつ分注する。 注：この段階で、100 mlの赤芽球（細胞密度 0.2x10^6/ml）を含む、MS-5細胞がコンフルエントに到達したフラスコが50本ある必要があります。6 cells/ml
      9. 0.05% EDTA含有トリプシンを用いて、残りのMS-5細胞5フラスコをT-175フラスコに1:5で希釈し、拡大培養する。最終細胞濃度は約0.08x10⁶/mLとする。6 細胞/ml 注：~0.08x10^6個のMS-5細胞を含むフラスコ20本6 cell/ml分を調製します。残りのMS-5細胞は凍結し、液体窒素中に保存してください。
    • 16日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤芽球をカウントして死細胞を除外し、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約4 ml）を回収する（段落6を参照）。 注：細胞密度は～0.6x10⁶にする必要があります。6 細胞/ml
  5. ステップ 4：18～26日目
    赤血球系細胞を3～4倍に濃縮し、5～7x106 cell/mlの最終濃度とし、成熟させるためにMS-5層上で維持した。培養赤血球（cRBCs）をより良好に保存するため、補完されたIMDM培地に10% FBSを添加した。
    • 18日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤芽球数を計測し、死細胞を除外した上で、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約2 ml）を回収する（段落6を参照）。 注：細胞密度は約1.7x10にする必要があります。6 細胞/ml
      2. 1xPBS 300mlおよび、10% FBSを含むサプリメント添加IMDM培地（表2）1.5Lを37°Cで予熱する。
      3. コンフルエントなMS-5細胞が入った15本のフラスコを、それぞれ20 mlの1xPBSで洗浄し、直ちに各フラスコに80 mlの新鮮なサプリメント添加IMDM培地を加えてください。
      4. 赤血球系細胞（すなわち85x10^6個相当）を遠心分離し、8 （細胞）を450 gで10分間遠心分離し、ペレットをまとめて4本のコニカルチューブに分注する。
      5. 各細胞ペレットを、10% FBS含有補充IMDM培地75 mlで再懸濁し、この細胞懸濁液を20 mlずつ、MS-5細胞と80 mlの培地が入った15本のフラスコそれぞれに分注する。 注：この段階で、6x10^x個（※原文の指数が欠落していますが、数値に従ってください）の赤芽球を含む100 mlの培地が入った、MS-5細胞がコンフルエントになった15本のフラスコが準備できている必要があります。6 細胞/ml
      6. 0.05% EDTA含有トリプシンを用い、残りのMS-5細胞5フラスコをT-175フラスコに1:5で希釈して拡大培養する。最終細胞濃度は～0.08x10⁶とする。6 細胞/ml 注：MS-5細胞を約0.08x10⁶個で20フラスコに分注6 cell/ml分を調製してください。残りのMS-5細胞は凍結し、液体窒素中で保存します。
    • 20日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤芽球数を計測して死細胞を除外し、試験に必要な細胞数（すなわち培養液約1.5 ml）を回収する（段落6を参照）。 注：細胞密度は約1.5x10に維持される。6 細胞/ml
    • 22日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤芽系細胞をカウントし、死細胞を除外した上で、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約1.5 ml分）を回収する（段落6を参照）。 注：細胞密度は~1.5x10に維持する6 細胞/ml
      2. 18日目の手順に従い、培地を交換し、赤芽系細胞を新しいMS-5細胞層上に移してください。
    • 24日目：
      1. トリパンブルーを用いて赤芽系細胞を計数して死細胞を除外したあと、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約1.5 ml）を回収する（パラグラフ6を参照）。 注：細胞密度は約1.5x10に維持される。6 細胞/ml
    • 26日目：
      1. Trypan blueを用いて赤芽球数を計測して死細胞を除外し、試験に必要な細胞数（すなわち、培養液約1.5 ml）を回収する（パラグラフ6を参照）。 注：細胞密度は約1.5x10^6/mLに維持される。6 細胞/ml
      2. 非粘着性の、核が除去され完全にヘモグロビン化したいcRBCを回収する。 注：成熟cRBCは、SAGM培地（MacoPharma）を用い、4°Cで最大1か月間保存可能です。
  6. 試験および代表的な結果
    適切な細胞増殖および赤芽球分化を確認するため、指定された日に以下の試験を実施する。図に示した代表的な結果は、CD34を用いて得られたものである。+ 白血球成分採取術（レューカフェレーシス）により分離された細胞。
    1. 細胞数は2日ごとにカウントする。細胞増殖の代表的な結果は図2を参照されたい。
    2. May-Grünwald Giemsa形態染色を、0.05 x10を用いて2日ごとに実施します。6 0日目から8日目までの細胞、および0.2x106 その他の日の細胞については、ギムザ染色の製造元の指示に従って染色した（表1）。代表的な結果を図3に示す。
    3. 造血前駆細胞を測定するため、0日目から12日目まで2日ごとに、0.01x10[数値欠落]を用いて半固形培地アッセイを2連（duplicate）で実施する。6 Methocult半凝固培地の製造者の指示に従い（表1）、1アッセイあたり〇〇個の細胞を使用する。代表的な結果は図4を参照されたい。
    4. 以下の細胞マーカーの解析を、0.2 x 10^6 個の細胞を用いて2日ごとにFACSで実施する：CD34、CD36、CD71、GPA、LDS6 アッセイあたりの細胞数。代表的な結果は図5を参照。
    5. ヘモグロビン量は、ベンジジン染色により2日ごとに測定する。代表的な結果を図5に示す。
    6. 遺伝子発現は、1x10^6 個の細胞からRNAを抽出した後、RT-qPCRまたはマイクロアレイを用いて解析されます。6 細胞。代表的な結果は図6Bを参照すること。

結果に関する考察：

図1は、ヒトCD34+細胞を成熟したヘモグロビン含有赤血球へex vivo分化させるためのプロトコルを示している。赤血球分化の間、細胞は高い増殖能を示す。これは、白血球アフェレーシスから単離したCD34+細胞を用いて得られた図2の約8,000倍の増幅によって示されている。骨髄から単離したCD34+細胞の増殖能はわずかに低く、約6,000倍の増幅である一方、臍帯血から単離したCD34+細胞は50,000倍の増幅に達することがある。分化の特定の段階にある細胞は、図3に示すような識別可能な大きさおよび形態を示す。20日目から始まる分化の最終段階で起こる脱核の過程に注目されたい。26日目には、すべての細胞が核を消失している（図3）。

図4に示すコロニー形成アッセイは、分化の初期段階（Day 0からDay 8）における早期および後期の造血前駆細胞を検出するために用いられます。赤芽球系前駆細胞（CFU-EおよびBFU-E）に加えて、Day 0の初期CD34+細胞内には顆粒球・単球系前駆細胞（CFU-GM）が有意に存在することが分かります。分化が進むにつれてCFU-GMは著しく減少し、Day 6までには赤芽球系前駆細胞であるBFU-EおよびCFU-Eに完全に置き換わります。また、Day 4からDay 6にかけて、早期赤芽球系前駆細胞であるBFU-Eが、より分化したCFU-Eへと段階的に置き換わる点も重要です。Day 10までには、赤血球系細胞は本質的にコロニー形成能を喪失します。

最後に、図5に示すように、細胞表面マーカーの発現によって赤血球造血をモニタリングします。以下の点に注意してください：1) 造血幹細胞/前駆細胞マーカーCD34の漸次的な消失、2) 前駆細胞マーカーCD36の漸次的な獲得および消失、3) 赤芽球前駆細胞および網状赤血球マーカーCD71の漸次的な獲得および消失、そして 4) 赤血球系前駆細胞および赤血球マーカーGPAの増加。赤血球分化のその他の指標には、8日目から始まるヘモグロビン合成（ベンジジン染色により測定、図5）および、DNA染色剤LDSの消失によって測定される20日目から始まる細胞の脱核（図5）があります。最終的に、赤血球分化は、転写因子TAL1（図6B）やβ-グロビン遺伝子（データは示していない）などの分子マーカーのRT-qPCRによって測定することが可能です。

通常、臍帯血 / 白血球アフェレーシス / 骨髄の1 mlあたり 0.35x105 / 0.5x105 / 1.1x105 個のCD34+ 細胞が含まれており、それぞれの増殖率 50,000 / 8,000 / 6,000 で、理論的に 1.7x109 / 0.4x109 / 0.7x109 個の赤血球を産生できます。分化手順の終了時に 50x106 個の赤血球を得るには、約 50 ml の培地が必要です。

パートII. ex vivo 赤血球分化におけるレンチウイルス媒介ノックダウン

レンチウイルスは、ヒト一次細胞への遺伝子導入において最適なツールです（例として Amsellem et al. 9 を参照）。 レンチウイルスは、標的shRNAを導入することで、一次細胞内の標的遺伝子をノックダウンさせるためによく用いられます（例として Laurenti et al. 10 を参照）。本プロトコールでは、ヒト一次赤芽球系細胞において転写因子TAL1を標的とします。既知のどの遺伝子にも対応しないスクランブル配列を持つshRNAを、陰性対照として使用します。また、導入効率の評価にはGFPの発現を利用します。

1. レンチウイルスベクター粒子の調製

レンチウイルス粒子を得るために、ヒト胚性腎臓293T細胞に3つのプラスミドを共導入します。1つはenv、vpr、vif、vpu、nefを除くHIV-1遺伝子をコードする第2世代ウイルスパッケージングシステム（すなわちpsPAX2）、もう1つは水疱性口炎ウイルスG擬似型ウイルスのエンベロープをコードするもの（すなわちpMD2G）、そして最後は目的遺伝子をコードするレンチウイルスベクター（TAL1 shRNAをコードするpBLOCK-it6-DEST(shTal1)、スクランブルshRNAをコードするpBLOCK-it6-DEST(shScr)、またはGFPをコードするpWPIP）（表4）です。レンチウイルス粒子は、トランスフェクションした293T細胞の培養上清から回収します。

細胞への不必要な感染を避けるため、すべてのレンチウイルス実験（ウイルスの調製および感染）は、他の細胞培養とは別の専用フード内で行います。また、レンチウイルスによって生成された廃棄物は、分別して廃棄します。本プロトコルで述べる第2世代レンチウイルスは複製不能であり、バイオセーフティーレベル2（BSL-2）の生物として取り扱う必要があります。施設によってはレンチウイルスに関する特定の安全手順が定められている場合があるため、確立された施設内ガイドラインに従うことを推奨します。

ここでは、分化のどの段階においても100万から200万個の一次赤芽球を感染させるのに十分な量のレンチウイルス粒子を調製するプロトコルについて説明します。スケールアップまたはスケールダウンに応じて、液量は適宜調整してください。試薬については表4および表5を参照してください。

  1. リン酸カルシウム法による293T細胞へのトランスフェクション
    1. トランスフェクションの1日前、10% FBSおよびPen/Strepを含む20 mlのDMEM/High glucose培地を用い、15-cm細胞培養ディッシュに13.2 x 106個の293T細胞を播種する。注：これにより、トランスフェクション当日に細胞が70%コンフルエントになる。低継代（<20）の293T細胞を使用すると最良の結果が得られる。
      オプション：293T細胞の接着性を高めるため、ディッシュをタイプIコラーゲンまたはポリLリシンでコーティングしてもよい。
    2. トランスフェクションの2時間前、293T細胞から培地を吸引し、37°Cに予熱した新鮮な培地20 mlを静かに加える。注：通常、トランスフェクションは一日の終わりに開始する。
    3. 5 mlチューブに以下の試薬を混合する：
      • 目的遺伝子の発現ベクター 44.8 μg（例：shRNAまたはGFP、表4を参照）
      • pMD2.Gエンベロープベクター 13.35 μg
      • psPAX2パッケージングベクター 33.48 μg
      • 滅菌H2Oを加えて、全量を1.116 mlにする。
    4. 滅菌H2Oを加えて、全量を1.116 mlにする。
    5. 2.5M CaCl2 109.8 μlを加え、ボルテックスで混合する。
    6. 50 mlコニカルチューブに、2xHBSバッファー（表5）1.116 mlを加える。
    7. 常にボルテックスで撹拌しながら、DNA混合液を2xHBSバッファーに滴下して加える。
    8. 室温で20分間（30分を超えないこと）静置し、沈殿を形成させる。
    9. 2.3 mlの溶液を293T細胞を含むディッシュに滴下して加え、静かに回転させ、37°Cのインキュベーターで12〜14時間培養する。
    10. 翌朝の早い時間に培地を吸引し、37°Cに予熱した新鮮な培地20 mlに交換する。
  2. レンチウイルスの回収および濃縮
    1. トランスフェクションの48時間後、レンチウイルスを含む培地20 mlを回収し、50 mlコニカルチューブに移す。
    2. 293T細胞に37°Cに予熱した培地20 mlを加え、インキュベーターに戻す。
    3. ウイルスの培養上清を450 gで10分間遠心分離して細胞残渣を除去し、新しい50 mlチューブに移す。あるいは、上清を0.45μmフィルターでろ過してもよい。清澄化した上清は4°Cで保存する。
    4. 24時間後、残りの培地20 mlを回収する。注：2回の回収でウイルスタイターはおおよそ同等（すなわち 1x 106 TU/ml）であることが確認されている。
    5. ウイルスを濃縮するため、ウイルス上清をBeckman OptiSealチューブに分注し（1本あたり32.4 mlの上清を使用）、スイングローターを用いて4°C、100,000gで1.5時間遠心分離する。注：ウイルス上清の代替濃縮法として、47,000 gで2時間、または3,000 gで8時間の遠心分離がある。濃縮前にウイルスを凍結させないこと。凍結させるとタンパク質が沈殿し、ウイルスの再懸濁が困難になる。
    6. 超遠心分離後すぐに、10 mlプラスチックピペットを用いて上清をゆっくりと吸引して捨てる。注：チューブから剥がれやすいペレットを乱さないように注意すること。最初の5 mlの上清を捨てた後、通常は超遠心チューブの上部をカットして、上清をできるだけ多く除去する（つまり、チューブ底に約100-200 μlの培地が残る程度にする）。
    7. 1xPBS 100 μlを加え、室温で30分間ペレットを溶解させ、ピペッティングで15〜20回上下に混ぜて再懸濁する。注：通常、約200-300 μlの濃縮ウイルスが得られる。
    8. 濃縮したレンチウイルス調製液のタイターは、Invitrogen社のプロトコル（Block-it lentiviral RNAi Expression System）に従い、NIH3T3細胞を用いて測定する。注：通常、2〜10x108 transducing units (TU)/mlのウイルスタイターが得られる。
    9. これでウイルスを感染に使用できる（段落2を参照）。または、分注して-80°Cで最大6ヶ月間保存できる。注：ウイルス懸濁液を1回を超える凍結融解サイクルにさらさないこと。ウイルスは37°Cで4-5時間、室温で2-3日、または4°Cで1週間安定である。

2. 遺伝子導入のための初代赤芽球へのレンチウイルス感染

  1. 感染
    有核赤芽球は、50-100という高いMOI（感染多重度）を使用すれば、分化のどの段階においても効率的に感染させることができます。 ここでは、TAL1またはスクランブルshRNAを発現するレンチウイルスを用い、分化8日目と9日目にMOI 50 TU/cellで赤芽球に感染させる典型的な実験について説明します。RT-qPCRによりTAL1 KDのレベルを確認するため、24時間ごとにRNAを抽出します。また、感染効率を評価するために、FACSを用いてGFP発現を並行して測定します（代表的な結果は図6を参照）。
    • 0日目：
      1. 赤芽球をそれぞれ1x106個ずつ含む15 mlコニカルチューブを3本準備します（すなわち、TAL1ノックダウン用、スクランブル陰性対照用、GFP発現対照用に各1本）。
      2. SCFおよびEPOを含む補充IMDM培地（パートIを参照）5 mlで細胞を洗浄し、200 gで5分間遠心分離して、上清をできるだけ除去します。
      3. 濃縮ウイルス溶液に、最終濃度40 μg/mlとなるようにポリブレン（表4）を添加します。
      4. ポリブレンを含む濃縮ウイルス100 μl（すなわち5x107 TU）を、赤芽球の各チューブに添加します。
      5. 37°Cのインキュベーターで1時間インキュベートし、10分ごとにフィンガータッピングで混合します。注意：レンチウイルスの細胞への吸着を最大化させるため、感染は最小限の量の培地で行う必要があります。また、10分ごとに混合することで、細胞全体にウイルスを均一に分散させることができます。
      6. 各チューブに、SCFおよびEPOを含む補充IMDM培地（表2および3）900 μlを添加します。
      7. 各サンプルを6ウェルプレートに移し、37°Cのインキュベーターで24時間培養します。
    • 1日目：細胞を個別の15 mlチューブに回収し、200 gで5分間遠心分離して上清を除去し、感染手順（上記のステップbからg）を繰り返します。
    • 2日目：細胞を洗浄し、SCFおよびEPOを含む補充IMDM中で0.2x106 cell/mlに再懸濁し、パートIと同様に進めます。
  2. 代表的な結果
    図6Aは、初代赤芽球へのレンチウイルス感染とそれに続くRNA抽出のプロトコルを示しています。ある実験において、転写因子TAL1を標的としたshRNAまたはスクランブル対照を産生するレンチウイルスを赤芽球に感染させました11。図6Bは、初代赤芽球においてTAL1転写物の75%をノックダウンさせることに成功したことを示しています。また、スクランブル対照において9日目から12日目にかけてTAL1転写物レベルが増加していることにも注目してください。これは、赤芽球分化におけるこの転写因子の重要性を裏付けています。別の実験では、GFPタンパク質を発現するレンチウイルスを赤芽球に感染させました。図6Cは、感染から3日後、顕微鏡下の蛍光観察およびFACSによる測定で、ほとんどの赤芽球（87%）がGFPを発現していることを示しています。これは、初代赤芽球における高い感染効率を示しています。以前、0日目のCD34+細胞においても同様の感染効率で感染させています（データは示さず）。初代細胞を効率的に導入するための最も重要なパラメータは、高いMOI（すなわち濃縮レンチウイルス）を使用することです。低いMOI（すなわち非濃縮ウイルス）を使用した場合、導入効率は低下します。

3. 代表的な結果

CD34+ HSCsのポジティブ選択分離の概略図；免疫磁気的分離、無血清赤血球分化
図 1. ヒト初代造血幹・前駆細胞の分離およびex vivo赤血球分化のプロトコル概要。(ステップ1) ポジティブ免疫磁気選択を用いて、臍帯血、骨髄、またはG-CSFで動員されたヒト末梢血（白血球アフェレシス）からCD34+細胞（純度 95 ± 3%）を分離する。(ステップ2) 分離したCD34+細胞を、示された4ステップのプロトコルに従って液体培養にて増殖させる。

細胞増幅グラフ；対数スケール；培養日数 vs. 細胞増殖トレンド解析。
図2. ex vivo 赤血球分化プロトコルにおける細胞増幅。 結果は対数スケールで表示している。白血球アフェレシスから単離したCD34+細胞を用いて得られた代表的な結果である。

赤血球造血のステージチャート。26日間にわたる赤血球の発達を追跡した顕微鏡画像。
図3. ex vivo赤血球分化における細胞形態解析。 分化の指定された時点において、細胞をMay-Grünwald-Giemsa試薬で染色した（倍率x 40）。HSC: 造血幹細胞/前駆細胞; BFU-E: 赤血球系バースト形成単位; CFU-E: 赤血球系コロニー形成単位; Pro EB: 前赤芽球; Baso EB: 塩基性赤芽球; Poly EB: 多染性赤芽球; Ortho EB: 正染性赤芽球; RET: 網状赤血球; RBC: 赤血球。

半固体培地アッセイチャート。前駆細胞の増殖：CFU-GM、BFU-E、CFU-E。細胞培養日数。画像の比較。
図4. 造血前駆細胞を検出および定量するためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ。 指定した時点で、赤芽球系前駆細胞（BFU-EおよびCFU-E）および顆粒球・単球系前駆細胞（CFU-GM）の最適な増殖を促進するため、rh SCF、rh GM-CSF、rh G-CSF、rh Il-3、rh EPOなどのリコンビナントヒトサイトカインを含む半固体メチルセルロース培地に104個の細胞を播種した。BFU：バースト形成単位、CFU：コロニー形成単位。BFU-EおよびCFU-Eの代表的な写真も示す。BFU-EおよびCFU-Eのヘモグロビン化による赤褐色の着色に注目されたい。

細胞マーカーCD34、CD36、CD71、GPA、ベンジジン、LDSの経時的な造血分化グラフ。
図 5. ex vivo赤血球分化における造血/赤血球系マーカーのキネティクス。 指定したタイムポイントで2x105個の細胞を回収し、FACS（CD34、CD36、CD71、GPAおよびLDS）または顕微鏡観察（ベンジジン）により、指定したマーカーの発現を解析した。棒グラフは陽性細胞の割合を示す。CD34：ヒト造血幹細胞/前駆細胞に存在する膜貫通糖タンパク質、CD36：前駆細胞に存在するトロンボスポンジン受容体、CD71：赤血球系前駆細胞および網状赤血球に存在するトランスフェリン受容体、GPA：赤血球系前駆細胞および赤血球に存在するグリコフォリンA、Benzidine（ベンジジン）：ヘモグロビン染色、LDS：レーザーダイ・スチリル（DNA染色）。

レンチウイルスshRNA感染タイムライン、TAL1 mRNA発現棒グラフ、GFP顕微鏡写真、フローサイトメトリー。
図6. ヒト原系赤芽球におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入。(A) レンチウイルス遺伝子導入システムを用いた、原系赤芽球におけるTAL1ノックダウン（KD）誘導のタイムライン。(B) TAL1ノックダウンは、レンチウイルスで導入したanti-Tal1 shRNA（TAL1 KD）またはスクランブルコントロールshRNA（Scr）によって行われた。TAL1 mRNA転写産物レベルのキネティクスをRT-qPCRで測定した。TAL1転写産物は18S RNAに対する相対値として発現している。(C) レンチウイルスで導入したGFPを顕微鏡（左パネル）またはFACS（右パネル）で確認した。細胞の87%がGFP陽性であった。

4. 材料

試薬メーカーカタログ番号
RPMI 1640 SigmaR8758
コラゲナーゼ BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
分離前フィルター (30μmナイロンメッシュ)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x 赤血球溶血バッファーStemCell Technologies20120
CD34 MicroBead キットMiltenyi Biotec Inc130-046-703
LS Mini-Macs カラムMiltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS Running Buffer-MACS Separation BufferMiltenyi Biotec Inc130-091-221
MiniMACS セパレーターMiltenyi Biotec Inc130-042-102
マウス骨髄ストローマ細胞 MS-5 (定期的にマイコプラズマ汚染の検査を実施すること)DSMZACC 441
トリパンブルー溶液 (0.4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
トリプシン 0.05%/EDTAThermoScientific J101521
メイ・グリュンウォルド・ギムザ染色液 Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Methocult ヒト細胞用コロニー形成細胞 (CFC) アッセイ StemCell Technologies 04044

表1.

成分ストック溶液添加量 600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
Pen/Strept 1% (vol/vol)Gibco 103786ml
L-glutamine 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
調製方法 : 粉末 28 mg を 7 ml の IMDM に溶解し、フィルター滅菌する。 4°C で 1 週間安定。		6ml
Folic acid 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
調製方法 : 粉末 7 mg をあらかじめ加温した 7 ml の IMDM に溶解し、フィルター滅菌する。 4°C で 1 週間安定。使用前に加温すること。		6ml
Monothioglycerol 1.6x10-4M0.16M (Sigma M6145)
調製方法 : 11.56M ストック溶液 10 μl を 712 μl の IMDM に溶解し、フィルター滅菌する。 4°C で 1 週間安定。		0.6ml
Ferrous nitrate 90 ng/ml18μg/ml ( Sigma 8508)
調製方法 : 1.8 mg を 1ml の蒸留水に溶解する。その溶液 0.1 ml を取り、9.9 ml の IMDM を加えてフィルター滅菌する。 4°C で 1 週間安定。		3ml
Ferrous sulfate 900 ng/ml180 μg/ml ( Sigma F8633)
調製方法 : 18 mg を 1ml の蒸留水に溶解する。その溶液 0.1 ml を取り、9.9 ml の IMDM を加えてフィルター滅菌する。 4°C で 1 週間安定。		3ml
Bovine serum albumine-Insulin-Transferrin (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

表2.

成分ストック溶液添加量（サプリメント添加IMDM 100 mlあたり、表2参照）
ヒドロコルチゾン (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
調製方法: 5mgの粉末を1.03mlのIMDMに溶解させる。0.1 mlを取り、9.9 mlのIMDMを加えてフィルター滅菌を行う。4°Cで1週間保存可能。		1ml
幹細胞因子 (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
調製方法: 50 μgの粉末を500 μlのPBS+0.1% BSAに溶解させ、フィルター滅菌を行う。100 μlずつ分注し、-20°Cで保存する。		100 μl
エリスロポエチン (EPO) 3 IU/ml12,000UI/ml相当の100 μg/ml (Feldan FB03-10-290)
調製方法: 50 μgの粉末を500 mlのPBS+0.1% BSAに溶解させ、フィルター滅菌を行う。25 mlずつ分注し、-20°Cで保存する。		25 μl
インターロイキン3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
調製方法: 10 μgの粉末を100 μlのPBS+0.1% BSAに溶解させ、フィルター滅菌を行う。5 mlずつ分注し、-20°Cで保存する。		5 μl

表3.

試薬供給元参照
293T 細胞
(定期的にマイコプラズマ汚染検査を行う) 		ATCCCRL-11268
DMEM/High GlucoseThermoScientificSH30243.01
ヘキサジメシン臭化物 (Polybrene)SigmaH9268-5G
OptiSeal 超遠心チューブBeckman Coulter361625
psPAX2 プラスミドAddgene (D. Trono laboratory)12260
pMD2.G プラスミドAddgene (D. Trono laboratory)12259
pBLOCK-it6-DEST (shTal1) プラスミドInvitrogen製のpBLOCK-it6-DESTプラスミドにクローニングしたTal1 shRNA配列Palii et al. EMBO J.
pBLOCK-it6-DEST (shScr) プラスミドInvitrogen製のpBLOCK-it6-DESTプラスミドにクローニングしたスクランブルshRNA配列Palii et al. EMBO J.
pWPI プラスミドAddgene (D. Trono laboratory)12254

表 4.

緩衝液調製方法最終濃度
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • Milli-Q水を加える。
  • NaOH溶液を加えてpHを正確に7.11-7.13に調整し、Milli-Q水で100 mlにする。
  • pHを7.11-7.13に微調整する。
  • フィルター滅菌し、10 mlずつ分注して-200Cで保存する。
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g 無水CaCl2
  • 10 mlのMilli-Q水に溶解させる。
  • フィルター滅菌し、1 mlずつ分注して-20°Cで保存する。
  • 2.5M
MS30
  • [2M] Tris pH8.0 を25ml
  • [0.5M] EDTA を5ml
  • グリセロール 300ml
  • 50mM
  • 2.5mM
  • 30% (v/v)

表 5.

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ディスカッション

メソッドの数は、成功の可変度と文化の中で赤血球系細胞を区別するために以前に使用されている。例えば、MS - 5上で共培養することなく一部のプロトコルは、赤血球系細胞の拡張を使用できますが、12月17日 、完全に成熟した除核赤血球の生産に効率的ではありません。他の方法が効率的に眼球摘出を可能にする一方で、それが増殖18,19を犠牲にしています。我々が最初にDouay研究室6で開発された、ここで使用されている方法は、（ゲノミクスおよびプロテオミクス研究のために必要な）赤血球分化の初期段階で細胞の増幅を長引かせるため、早期の前駆細胞の多数を提供してくれる最初の液体培養工程を、組み合わせたもの、およびヘモグロビンの合成を最大化すると赤血球の完全摘出を取得することが重要であるMS - 5間葉系細胞、上の共培養の第二段階。私たちのメソッドの2つの制限は、これまで完全に蛋白質のレベルと、このプロトコルを実行する2）高コストで、非常に初期の赤血球前駆細胞を特徴づけるために私たちを妨げている分化の初期段階での増幅の1）はまだ不十分な程度であり、特に大規模で。

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開示事項

利害の衝突は宣言されません。

謝辞

我々は、血液サンプルを提供するためL. DouayとMC Giarratana（大学パリVI、フランス） のex vivo赤血球分化についてのアドバイス、D.アランとH.アトキンス（オフジー、カナダの）感謝（オタワ病院研究倫理審査会で得られた＃ 2007804 - 01H）、批判的に原稿を読み取るためのレンチウイルスベクターとFJディルワース（オフジー、カナダ）を提供するためのD. Trono（エコール連邦工科大学ローザンヌ校）。このプロジェクトはMBCGPにCIHRの助成金（MOP - 82813）によって賄われていたオンタリオ州の研究基金計算Regulomicsトレーニングポストドクトラルフェローシップの受賞者です。 MBは遺伝子発現調節のカナダリサーチチェアを保持しています。

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参考文献

  1. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
  8. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
  16. Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

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