強化されたバイオセーフティのためのポリマー複合エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞のトランスダクション

サマリー

レンチウイルスは、遺伝子機能を探索するための貴重な研究ツールですが、研究者は、既知または疑われる癌遺伝子をコードしてパントロピックレンチウイルスの産生を回避する場合があります。別の方法として、我々はエコトロピック受容体mSlc7a1を表現するように修正ヒト細胞でのエコトロピックレンチウイルスの使用のためのより安全なプロトコルを提示する。

要約

幹と腫瘍細胞生物学の研究は、多くの場合、検査技師のための主要な安全性の問題を上げる、もしくはそれが疑われる癌遺伝子とヒト細胞のウイルスの伝達を必要とする。彼らは非分裂細胞を含む多くの細胞型を、形質導入できるため、そのような一般的に使用されるVSV - Gシューのようなパントロピックレンチウイルスは、遺伝子機能を研究するための貴重なツールです。しかし、研究者は、より高い生物学的安全性レベルの処理要件と安全性の問題に起因する癌遺伝子をエンコードするパントロピックウイルスの生産と遠心分離を回避する場合があります。 c - MycおよびSV40ラージT抗原を含むいくつかの強力な癌遺伝子は、誘導多能性幹細胞（IPSC）の生産を高めることが知られている。他のすべての既知のIPSC誘導遺伝的変化（OCT​​4、SOX2、KLF4、NANOG、LIN28、および機能のp53の損失）も癌へのリンクを持っている、だけでなく、比較的高い安全性の懸念から、それらを作る。

これらの癌に関連したウイルスが細胞のリプロ​​グラミングと多能性を研究する上で有用であるが、それらが安全に使用する必要があります。これらの生物学的安全性の問題に対処するために、我々は、コスト削減と簡便な操作で追加の重点を置いて、エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞の形質導入のための方法を示しています。我々は、受容体発現ヒト細胞は、このアプローチの有効性を検証、ウイルスに暴露の90％以上を形質導入する十分に高い力価を持つエコトロピックレンチウイルスを生産している。

レンチウイルスは、多くの場合、超遠心分離によって濃縮されますが、このプロセスには数時間かかりますし、人間の生物医学研究者への感染性エアロゾルを生成することができます。別の方法として、ウイルス粒子は、より安全にコンドロイチン硫酸とポリブレン（CS / PB）との複合体によって細胞上に沈降することができます。この手法は、安定的に無視できる追加の時間とコストで、マウスレトロウイルス受容体を発現する細胞で3倍にする機能的なウイルスの力価を増加させる。ヒト皮膚線維芽細胞（HDFS）の形質導入は、最大限そのポリマー濃度は、目的の標的細胞のタイプのために滴定する必要が示唆し、以前に癌細胞株で報告された最適値に比べ約4倍低いCS / PB濃度を用いて強化されています。そこで、新たな細胞タイプにおけるポリマーの毒性のアッセイにmethylthiazolyldiphenyl -テトラゾリウムブロマイド（MTT）の使用について説明します。私たちは、最小限の急性毒性を示す、ポリマーの錯体形成またはポリブレン（PB、6μg/ ml）での標準用量のいずれかを使用してウイルスの導入後HDFSの同等の生存率を観察。

このプロトコルでは、我々は生物学的安全性のリスクを低減し、伝達率を増加させる、ヒト細胞における癌遺伝子の過剰発現のためのエコトロピックレンチウイルスの使用を説明します。我々はまた、ウイルス粒子のエアロゾル形成遠心分離を回避しながら、伝達を強化するためにポリマーの錯体化の使用を示します。

プロトコル

1. レンチウイルスの作製、回収、および凍結保存

1. このプロトコルを開始する前に、所属機関の安全責任者に相談し、推奨される安全ガイドラインに従ってください。
2. 1日目。 ウイルス作製のため、健康で増殖速度の速い293T細胞を用います。10 cmプレートあたり5 x 10⁶個の細胞を播種します。ウイルス作製には、抗生物質を含まない293T培地（10% FBSおよび4 mM L-glutamineを含む高グルコースDMEM）を使用してください。
3. 2日目。 午後遅くに、以下のように293T細胞にトランスフェクションを行います（数値は10 cmプレート1枚分です）。すべての試薬を室温に戻します。マイクロ遠心チューブに375 μlのOptiMEMをピペッティングし、25 μlのFugene HDを加えます。希釈されていないFugeneがチューブの壁面に接触しないようにしてください。
4. マイクロ遠心チューブ内で以下を混合します。
   • 5 μgのトランスファープラスミド（Slc7a1、ターゲットベクター、または蛍光コントロールベクター）
   • 3.75 μgのパッケージングプラスミド（pCMV-dR8.91またはpsPax2）
   • 1.25 μg エンベローププラスミド（パン・トロピック用はpMD2.G、エコトロピック用はpHCMV-EcoEnv）
   • 無血清OptiMEMを加えて100 μlにする
5. 2つのチューブを合わせ、混合液を室温で20〜30分間インキュベートします。
6. 293T細胞の培地を10 mlの新鮮な抗生物質なし293T培地に交換します。Fugene/プラスミド混合液をプレートに滴下し、37°C、5% CO₂で一晩インキュベートします。
7. 3日目。 293T細胞の培地を10 mlの新鮮な抗生物質なし293T培地に交換します。293T細胞は接着力が弱く、単層細胞に培地を強くピペッティングすると剥離することがあるため、慎重に操作してください。ウイルス作製のため、加湿インキュベーターで2日間インキュベートします。
8. 5日目。 ウイルスを回収し、0.45 mmの低タンパク結合フィルターでろ過します。直ちに使用するか、分注して-80°Cで冷凍保存してください。冷凍保存されたパン・トロピックウイルスおよびエコトロピックウイルスは、それぞれ6ヶ月後および1ヶ月後に再タイター測定を行う必要があります。
9. 導入効率が比較的高い細胞を用いて、以下のようにウイルスのタイターを測定します。新鮮な培地中で6 μg/mlのPBを用い、蛍光コントロールウイルスを段階希釈（例：1:10、1:100、1:1000）して一晩導入します。翌日に新鮮な培地に交換します。導入後、蛍光タンパク質の発現が始まるまで2日間待ち、FACSにより導入細胞の割合を決定します。多重導入イベントを最小限に抑えるため、導入率が< 15%となる希釈分に基づき、1 mlあたりのトランスフォーミングユニット（TU）としてタイターを算出します。
   

2. マウスレトロウイルス受容体Slc7a1を用いたヒト標的細胞の形質導入

1. ほとんどの細胞が導入されるように、感染多重度（MOI）= 2を選択します。HDFなどの導入効率が低い標的細胞の場合、より高いMOIが必要になります。我々は、大半の細胞に導入させるため、ウイルス上清を1:2にのみ希釈しています。
2. ウイルスと標的細胞間の静電的相互作用を強化して導入効率を高めるため、6 μg/mlのPBを含む新鮮な培地で希釈したウイルス上清を用いて、標的細胞を一晩導入します¹。拡散が導入効率の制限要因となるため、35 mmプレートに対して1 mlなど、最小限のウイルス量を使用することが理想的です。
3. Slc7a1受容体が十分に発現することを確認するため、ウイルスを除去した後、エコトロピックウイルスを導入するまで少なくとも48時間細胞を培養します。
4. （オプション）必要に応じて、ブラスチシジンを用いてSlc7a1を発現する安定導入細胞を選択することが可能です。あらかじめブラスチシジンのキルカーブを作成し、未導入の標的細胞を7日間ですべて死滅させる最低有効濃度（一般に2 – 10 μg/mlの間）を決定しておく必要があります。Slc7a1ウイルスを除去して約2日後に、導入細胞をブラスチシジン含有培地に変更します。ブラスチシジン含有培地で7日間培養すると、残存するすべての細胞がレトロウイルス受容体を安定的に発現するため、エコトロピックウイルスの導入が可能になり、また安定Slc7a1発現株として将来的に使用するために保存することができます。

3. 毒性を判定するためのポリマー複合体滴定

1. 1日目。 96ウェルプレートに、1ウェルあたり5000 cellsの密度で細胞を播種し、各実験群につき少なくとも3ウェルのトリプリケートを確保する。健康な細胞のベースライン値を得るために完全培地中の非導入細胞を含めるとともに、コントロールとして増殖停止を誘導するための無血清培地中の細胞サンプルも含める。並行して、各実験条件における導入効率を顕微鏡またはFACSで分析するため、適切な形式（24ウェルプレートなど）に細胞を播種する。
2. 2日目。 MTTおよびFACS分析の両方用に準備したプレートの細胞に、標的細胞の約40%を導入するようにMOI 0.5でGFPをコードするウイルスを導入する。最適量を決定するため、さまざまな濃度のCS/PB（例：各成分につき50、100、200、400、600、および800 mg/ml）および6 μg/ml PBをテストする。ポリマー複合体は、後述のパート4に従って調製する。
3. 3日目。 ウイルスを含む培地を除去し、新鮮な培地と交換する。プレートを加湿インキュベーターに戻す。
4. 5日目。 FACSプレートを分析し、各ポリマー濃度における導入効率を決定する。
5. 6日目。 MTTプレートの全ウェルから培地を除去し、100 μlのMTT溶液（完全培地中の1 mg/ml MTT）と交換する。加湿インキュベーター内で3時間培養し、代謝活性のある細胞のミトコンドリア内でMTTが還元されるようにする。
6. MTT溶液を除去し、200 mlのMTT溶媒（0.1 N HCl、0.1% Igepal CA-630含有イソプロパノール）と交換する。
7. 室温で2時間、あるいは紫色のMTTホルマザン沈殿が完全に溶解するまでインキュベートする。マイクロプレートリーダーを用いて570 nmで吸光度を測定し、690 nmでのバックグラウンド値を差し引く。
8. FACSで決定された導入効率の最大向上を示し、かつMTTで決定された代謝活性への影響が最小限である最適なポリマー濃度を選択する。HDFについては、以下に示す代表的な結果（Representative Results）のデータに基づき、100 μg/ml CS/PBを選択した。

4. ポリマー複合体を用いたエコトロピック導入

1. PBおよびコンドロイチン硫酸のストック溶液（水中で 20 mg/ml）を調製し、滅菌ろ過する。分注し、-20°Cで保存する。
2. ウイルス上清をマイクロ遠心チューブにピペットで移し、新鮮な培地を用いて目的の最終濃度（例：MOI 2）に希釈する。PBおよびコンドロイチン硫酸（濃度は上記ステップ3で決定）を等量ずつ順次加え、添加ごとにチューブを弾いて混ぜる。沈殿が形成されるため、ウイルス混合液は即座に白濁する。複合体を形成させるため、ウイルス混合液を室温で5分間インキュベートする。
3. 受容体発現標的細胞から培地を除去し、ウイルス混合液に置換して、37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートする。ウイルス混合液を除去した後、PBSで細胞表面を2回洗浄し、ウイルス複合体の除去を促進する。完全に除去する必要はなく、残留したポリマー複合体が細胞の健康状態に悪影響を及ぼすことは観察されていない。

5. エコトロピック導入の特異性の検証

1. エコトロピックウイルスを初めて作製する場合、安全性の観点から、そのウイルスが未修飾のヒト細胞を形質導入できないことを確認することが推奨されます。比較的高い濃度（新鮮な培地でウイルス上清を1～2倍に希釈したのみの状態）のエコトロピックレンチウイルスを、6 μg/mlのPBまたは最適化されたCS/PB濃度を用いて、一晩ヒト細胞に形質導入します。
2. ウイルスを含む培地を除去し、新鮮な培地と交換します。細胞を2日間培養した後、蛍光ベクターを用いたFACSまたはトランスジーン特異的プライマーを用いたRT-PCRにより、トランスジーンの発現を検証します。

6. 代表的な結果：

図1Aはレンチウイルスの作製プロセスを、図1Bはマウスレトロウイルス受容体Slc7a1による事前導入を含む、エコトロピックレンチウイルスを用いたヒト細胞への導入を示しています。ウイルスのタイター測定には、Slc7a1を安定導入したヒト横紋筋肉腫細胞株（Slc-hRMS）を使用します。導入効率をモニタリングするために蛍光コントロールベクターを使用した場合、図2Aおよび2Bに示すように、エコトロピックウイルスによるSlc-hRMSの導入効率は通常> 90%に達します。HDFの導入率は、受容体発現のためにブラスティサイジン選択が行われていないため、一般的に低くなります（図2C）。エコトロピックレンチウイルスのタイターは、Slc-hRMSで測定した場合、通常VSV擬似型ウイルスの10-20%となります（図2D）。

1回の凍結融解サイクルにより、エコトロピックウイルスのタイターは16～3%減少し、これはVSV擬似型ウイルスの1回の凍結融解サイクル中のタイター消失と同等であった（p > 0.05）。先行報告²とは異なり、ドライアイスでの急冷によるウイルスタイターへの正の効果は観察されなかった。むしろ、ウイルスの入ったチューブを単に-80°Cのフリーザーに入れることで、いずれの擬似型においても解凍後のより高いタイターが得られた（データは示していない）。

MTT生存率アッセイにより、標的細胞における増殖停止を感度よく検出することが可能です。ウイルスと最大800 μg/mlまでの濃度のCS/PBを用いた導入は、HDFの代謝に影響を与えません（図3A）。また、ウイルスを用いずにCS/PBにさらしても、細胞への毒性影響は見られませんでした（データは示さず）。ウイルスとさまざまな濃度のCS/PBを用いて導入したHDFのFACS解析では、PB単独と比較して導入効率の向上が認められました（図3B）。最大の向上は100 μg/mlのCS/PBで起こり（図3C）、これは以前に報告された値よりも数倍低い値です³。したがって、任意の標的細胞タイプに対して条件を最適化することが重要です。

CS/PBとの複合形成により、Slc-hRMSで観察されるタイターは約3倍向上した（図 4A, p < 0.01）。実際、これにより、高濃度のウイルスよりも低濃度のウイルスにおいて導入効率への影響がより大きくなる（図 4B）。これは、高濃度のウイルスでは細胞への多重導入や受容体の飽和が起こることが主な原因と考えられる。

エコトロピックウイルスの導入（トランスダクション）は、マウスレトロウイルス受容体を発現している細胞に特異的です。未改変のヒト細胞にエコトロピックウイルスを導入した場合、図5Aに示すように、PBまたはCS/PBのいずれを使用しても、未導入のバックグラウンドを超える蛍光は観察されませんでした。顕微鏡観察では、受容体がない状態ではHDFsに導入は見られませんでしたが（図5B）、受容体を事前に導入すると蛍光を発する細胞が認められました（図5C）。

図1. 〜の概略図 (A) ウイルス製造工程および (B) マウスレトロウイルス受容体によるヒト細胞の形質導入と、それに続くエクトロピックレンチウイルスの形質導入。

図 2. GFPをコードするエコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞の高効率形質導入。細胞はマウスレトロウイルス受容体Slc7a1で事前形質導入された。(A) Slc7a1についてブラスチシジン選択されたヒト横紋筋肉腫細胞株（Slc-hRMS）において、GFPで形質導入した細胞（青）と未導入の細胞（桃色）。(B) エコトロピックウイルスで形質導入したSlc-hRMSの蛍光顕微鏡写真（4倍）。(C) エコトロピックGFPレンチウイルスで形質導入した（青）および未導入の（桃色）HDF。細胞はエコトロピック形質導入の2日前にSlc7a1で形質導入された。(D) Slc-hRMSを用いて測定したVSV-G擬似型およびエコトロピックレンチウイルスのタイター。

図 3. ヒト皮膚線維芽細胞におけるコンドロイチン硫酸/ポリブレン (CS/PB) 濃度の最適化。(A) PBのみ、または異なる濃度のCS/PB存在下で導入を行った後の、MTTアッセイによるHDFsの生存率の測定。(B) FACSにより測定した、異なる濃度のCS/PBによるHDFsにおける導入効率の向上。(C) 導入促進の定量化。CS/PBが100 μg/mlの時に導入効率が最大になることを示している。

図4. エコトロピックレンチウイルスを用いたSlc-hRMSの導入に対する400 μg/ml CS/PBの影響。(A) タイターの向上、および(B) 6 μg/mlのpolybrene単独時と比較した導入率の倍率変化。

図 5. マウスレトロウイルス受容体Slc7a1が欠損している場合におけるHDFのエコトロピック導入の欠如。(A) BJヒト線維芽細胞のFACSプロット。いずれの場合も受容体Slc7a1が欠損しており、非導入（ピンク）またはエコトロピックGFPレンチウイルスを導入（青）した。エコトロピックGFPレンチウイルスを導入したBJヒト線維芽細胞において、受容体Slc7a1の事前導入を行わなかった場合(B)、および事前導入を行った場合（4X）(C)。

ディスカッション

モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）とその受容体のmSlc7a1に基づいて組換えエコトロピックgammaretrovirusよく研究し、広く利用されていますが、マウス細胞に導入遺伝子を提供するために20年以上に渡って使用されたこと。エコトロピックgammaretrovirusは、ヒトの細胞に癌遺伝子を提供するために最近でも使用されています。細胞のリプログラミングの文脈で、人間の癌遺伝子を保有する両種性ウイルスの発生を避けるためにmSlc7a1の使用は十分に確立されている^4,5しかし、レンチウイルスはgammaretrovirus上の大きな利点を提供します。レンチウイルスプレインテグレーション複合体ができるため、難治性の細胞集団、多くの場合、再プログラミングのための望ましい目標である^6を含む主要な細胞を、形質導入における非分裂細胞の伝達⁷

レンチウイルスは、ウイルスのトロピズム、毒性、およびその他のプロパティ⁸ MLV -シュードエコトロピックのレンチウイルスはマウス細胞^、9を形質導入するために使用されているが、ほとんどヒト細胞で使用されていないを変更するためにMLVを含むさまざまな疑似型の数十、、で生産されている^。10そこで、ヒトの細胞に細胞の初期化因子を含む、既知または疑われる癌遺伝子を、提供するために、安全で効果的なコスト、および高効率車両としてMLV -シュードエコトロピックレンチウイルスの使用を提案する。

それは、このプロトコルが完全にパントロピックレンチウイルスを生成して使用する必要性を排除しないことに注意することは重要であり、むしろ、このプロトコルは、癌に関連したウイルスで自己接種可能性から研究者を絶縁、パントロピックウイルスからがん遺伝子（s）を分離。タンパク質のmSlc7a1とそのヒト相同体のhSlc7a1は遍在^11はアンフォトロピックウイルスに組み込むための比較的低リスクのmSlc7a1を作る、知られている腫瘍形成またはレシピエント細胞の選択的な増殖優位性を付与する能力がないとアミノ酸トランスポーターを発現している。この追加ステップは、必要な生物学的安全性レベルの専用のウイルスまたは組織培養施設を欠いている研究室で特に有用である。

いくつかの状況でそれは完全に直接標的細胞へのプラスミドSlc7a1をトランスフェクトすることによりパントロピックウイルスの使用を排除することも可能ですが、この技術の有用なターゲットとなる多くの細胞はまた、トランスフェクションに難治性です。別の方法として、ブラストサイジン選択して細胞をSlc7a1 -形質分離する能力は、VSV - Gシュードタイプレンチウイルスはエコトロピックウイルスが多数のため、これらの細胞を形質導入する日常的に使用することができる後に受容体発現細胞のストックを生成するために一度だけ使用できることを意味します実験。研究者は関係なく、常にその親和性は、任意のレンチウイルスを操作するためのそれらの機関の安全ガイドラインに従ってください。

このプロトコルで実現さエコトロピックウイルスの力価は、以前の研究と一致で、一般的にVSV -偽型ウイルス、パントロピックウイルスの力価の10-20％、より適度に低くなる^。9これらの力価が安定してSlc7a1で形質導入ヒト細胞で測定したので、下エコトロピックウイルスのための観察力価は、標的細胞の受容体遺伝子の多様な発現に部分的に原因である可能性があります。それにもかかわらず、我々のプロトコルに到達ウイルス力価は、いくつかのケースでは、ほとんどのアプリケーションにとっては十分以上であり、細胞の大部分の伝達につながる>細胞の90％。

遠心分離ベー​​スの手法は一般的にウイルス粒子を濃縮するために使用されます。しかしながら、遠心分離は、数時間を必要とする感染性エアロゾルを生成し、ウイルス粒子の大幅な損失につながることができる^。12を別の方法として、CS / PBとの複合体がウイルス親和性を変化させることなく伝達を強化するために使用することができる^。3このメソッドは急速である（5分ほぼ観測された力価を3倍にしながら、（10 mlのウイルス当たり0.03ドル））と安価。特別な機器や独自の試薬 ​​は不要、と我々は他の細胞株での前作との契約で、CS / PBにHDFSの曝露後に最小の急性毒性を観察している。このプロトコルの¹³つの潜在的な欠点がいくつか微視的に見えるポリマーの複合体が付着することです。文化の中で数日間のための細胞。我々は、これらの複合体は、細胞への公然と毒性はないが、細胞のプロセスで、より微妙な影響を与えることがあるという可能性を排除できない。

ここでは、安全かつ効率的に発癌因子とヒトの細胞を形質導入するための方法論を記載している。このアプローチでは、iPS細胞を含む癌遺伝子と幹細胞生物学を研究に大変有用であるはず。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	マウスMLV受容体
pMD2.G	Addgene	12259	VSV - Gエンベロープ
のpCMV - dR8.91	D. Trono演習14		パッケージングプラスミド（等価なプラスミドpsPax2がAddgeneから入手可能です、猫。番号12260）
pHCMV - EcoEnv	Addgene	15802	エコトロピック封筒
FUGW	Addgene	14883	GFPコントロールプラスミド
OPTIMEM	インビトロジェン	31985
トランスフェHD	ロッシュ	04 709 705 001
ヘキサジメトリンブロマイド（ポリブレン）	シグマアルドリッチ	H9268
サメの軟骨からのコンドロイチン硫酸ナトリウム塩	シグマアルドリッチ	C4384
ブラストサイジンS	フィッシャー	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl -テトラゾリウムブロマイド（MTT）	シグマアルドリッチ	M2128
IGEPAL CA - 630	シグマアルドリッチ	I3021