本論文では、大動脈の免疫成分を調査するために、フローサイトメトリーベースの方法を提示。本稿では、また別々に周囲の外膜と血管壁を調べることができる追加のテクニックを示しています。このメソッドは、大動脈白血球の表現型解析を実行し、アテローム性動脈硬化症の研究のためにいくつかの免疫学的アッセイを適用する可能性を開きます。
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この記事について
サマリー
要約
アテローム性動脈硬化症は、泡沫細胞、免疫細胞、血管内皮細胞と平滑筋細胞、血小板、細胞外マトリックス、および広範な壊死を伴う脂質の豊富なコアで構成されたプラークの形成を特徴とされる中規模および大規模血管の慢性炎症性プロセスのことです周囲組織の線維化1免疫応答の自然免疫と獲得武器がアテローム性動脈硬化の開始、開発と持続性に関与している。2、3、証拠の重要な体は樹状突起は、マクロファージなどの免疫細胞の異なるサブセットがあるリンクです。細胞、TおよびBリンパ球は、4健康とアテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスの大動脈内に存在する。さらに、免疫細胞がアテローム発生にこの組織の重要な役割を示唆している周囲の大動脈外膜に記載されています。2
当分の間、免疫細胞、それらの活性化状態、および大動脈壁内の細胞組成の異なる種類の定量的検出は、アテローム性動脈硬化症の研究のためにRT - PCRと免疫組織化学的方法によって限定されていました。いくつかの試みが、人間の大動脈を用いてフローサイトメトリーを実行するために作られた、そしてこのような高い自家蛍光などのさまざまな問題は、5,6を報告されている。人間のアテローム性動脈硬化プラークは、コラゲナーゼ1で消化した、と自由な細胞はCD14のために回収し、染色した+ / CD11cは+マクロファージ由来泡沫細胞を強調する。本研究では、"モック"チャネルは、偽陽性染色を避けるために使用された。消化の過程で蓄積する6壊死性物質は大動脈の試料で高い自家蛍光を発生する破片が大量に生じさせる。この問題を解決するには、陰性および陽性対照のパネルが提案されているが、唯一の二重染色は、これらのサンプルに適用することができます。我々は、免疫細胞組成を分析し、活性化、増殖、健康とアテローム性動脈硬化症を起こしやすい大動脈の免疫細胞の分化を特徴づけるために新たなフローサイトメトリーベースの方法7を開発した。このメソッドは、大動脈壁の免疫細胞組成の調査を可能にし、この病気の免疫的側面の調査のための免疫学的方法の広いスペクトルを使用する可能性を開きます。
プロトコル
1。マウス大動脈の分離
手続きの制度的IACUCの委員会の承認は、マウスで動作するように要求される。
- 50ミリリットルのPBSと混合するためにチューブを反転するヘパリンナトリウム1000単位を追加してheparinzed PBSを準備します。血液および収集する各大動脈のためにPBSを含むコレクションチューブのための空のコレクションチューブを準備します。氷の上にすべてのチューブを保管してください。
- 、血液（1000 U / mlのヘパリンナトリウムの0.1ミリリットル）を描画するための注射器をヘパリンで治療する手術器具を（湾曲鉗子、解剖ハサミ、そしてmicroshearsのペア二組の）準備、および解剖のための解剖舞台。
- NIHと齧歯類の安楽死に関する機関IACUC委員会の方針は、次の承認チャンバー内に二酸化炭素を使用して、マウスを安楽死させる。解剖の段階にマウスを転送する前に有効性を確認してください。
- 簡単に言うと70％エタノールでマウスを浸して、解剖の段階にマウスを固定します。心臓穿刺を介してマウスから血液を描く。
- 腹部と胸の空洞を開きます。 25gの針と10mlのシリンジを使用して、完全にPBSを完全に心臓穿刺により血管から血液を除去するためにヘパリンの2％を含有する血管を灌流。大動脈組織内には血液がないことを確認してください。血流が血管壁内のすべてのプラークがそのまま残る....
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ディスカッション
ここで、我々はマウス大動脈の免疫細胞組成の調査のためにフローサイトメトリーベースの手法を提案する。この方法の主な利点は、単一細胞レベルで大動脈免疫細胞を分析すると大動脈白血球の活性化状態を特徴づけるためにできることです。このメソッドは、マウス大動脈に限定し、我々 （未発表データ）と、他の10は、内胸動脈、大動脈弁、冠状動脈のような人間の標本を分析するためにこのアプローチを使用されていません。この方法の一つの制限は、単一の大動脈を回収したマウス大動脈の白血球の相対的に低い数字です。単一のアテローム性動脈硬化症大動脈から回収した白血球の数はフローサイトメトリーの実験のための十分ですが、存在量の低い細胞が単一の大動脈の細胞懸濁液中に検出することが困難な場合があります。必要に応じて、この問題は、フローサイトメトリー染色2-4大動脈から組み合わせのサンプルを使用することによって回避することができます。さらに、酵素処理は、表面抗原の発現に影響を与える可能性があるので、酵素処理への耐性は、関心のあるすべての抗原について決定する必要があります。我々は以前に酵素消化7による影響を受けない、いくつかの抗原マー.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
PO1 HL55798（KLへ）とアメリカ心臓協会サイエンティスト開発グラント0525532U（例に）：この作品は、健康補助金の国立研究所によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 材料 | カタログ番号 | 会社 | |
| コラゲナーゼXI | C7657 | シグマアルドリッチ | |
| ヒアルロニダーゼ | H3506 | シグマアルドリッチ | |
| DNアーゼI、タイプ2 | D4527 | シグマアルドリッチ | |
| コラゲナーゼI | C0130 | シグマアルドリッチ | |
| コラゲナーゼII | LS004174 | ワーシントン生化学株式会社 | |
| エラスターゼ | LS002292 | ワーシントン生化学株式会社 |
参考文献
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P.
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再版と許可
