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方法論記事

マウスにおけるレーザードップラー流量計の指針と虚血性脳卒中に対する腔内中大脳動脈閉塞（MCAO）モデル

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DOI:

10.3791/2879

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2011年5月8日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

腔内中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルは、実験的虚血性脳卒中のモデルの中で最も頻繁に使用されるモデルです。ここでは、レーザードップラーフローメトリー、およびその代表的な結果のガイドで詳細にモデル全体のデモンストレーションを行います。

要約

ストロークは、2009年1,2年に米国で近く700億ドルの推定コストで、死因の第3位と世界で身体障害の主要な原因です。腔内中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルは、ラットではこのインパクトのある人間の病理をシミュレートするために1986年に小泉4で開発されました。 MCAOの方法の変更は、後にガ3で発表された。両方の技術が広く虚血性脳卒中との潜在的な治療法5から生じる脳損傷の分子機構を同定するために使用されています。ラットのこの比較的非侵襲的方法は、トランスジェニックおよびノックアウト系統6,7を利用するためにマウスで使用するように拡張されています。局所脳虚血モデルを作成するには、腔内縫合糸は、MCAのベースを閉塞するために内頸動脈を介して進められます。後退、一定時間経過後の縫合糸は、自発的な再灌流を模倣しているが、縫合糸はまた、恒久的に保持することができます。このビデオでは、段階的にマウスの腸管内MCAO手順を実行するための2つの主要な方法をデモンストレーションだけでなく、潜在的な欠点や落とし穴のための洞察を提供する予定。虚血脳組織は、その後、脳梗塞8の程度を評価するために2,3,5 -塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）で染色されます。

プロトコル

このプロトコルは、動物実験によって承認され、フロリダの大学で委員会（IACUC）を使用して、"実験動物のケアの原理"（NIH出版番号86から23まで、1985年改訂）に準拠していますれました。

1。材料

  1. 動物：手術の時に20〜26グラムの雄C57BL / 6マウス（ハーランラボラトリーズ、インディアナポリス、インディアナ州、米国）。
  2. 麻酔：
    1. 麻酔器：VetEquipの吸入麻酔システム（VetEquip社、プレザントン、カリフォルニア州、米国）。
    2. 吸入麻酔：イソフルラン（バクスターの医薬品、ディアフィールド、イリノイ州）。
  3. 手術器具：SuperCutアイリスはさみ、ストレート（世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州、米国）、Vannasマイクロシザー構造により、ストレート（世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州、米国）、デュモン鉗子（ファインチップ、 45 °曲げのヒント、世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州、米国）、バイポーラ凝固装置（高周波デシケーター900、世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州、米国）、マイクロ血管クリップ（世界の精密機器、 （株）、サラソタ、フロリダ州、米国）
  4. 外科電源：滅菌綿のヒント、ワイプ、ガーゼスポンジ、縫合糸（7-0絹縫合、エチコン社、サマービル、ニュージャージー州、米国）、組織接着剤（Vetbond、3M社、セントポール、ミネソタ州、米国）、手術スクラブ：Bethadine、70％エタノール、および生理食塩水0.9％滅菌、眼軟膏（Puralube獣医軟膏、Pharmaderm、メルヴィル、ニューヨーク州、米国）。
  5. MCAOのための咬合縫合の準備：
    1. MCA閉塞のためのフィラメント：7から0まで外科ナイロンモノフィラメント縫合糸（エチコン社、サマービル、ニュージャージー州、米国）。
    2. 縫合糸の先端（熱焼灼装置、世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州）を平滑化するための熱源。
    3. 液状シリコーンゴム（シリコーンRTV接着剤、世界精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州、米国）。
  6. 顕微鏡を解剖/外科（ライカの実体顕微鏡MZ6）。
    1. 光ファイバー照明（光ファイバー照明FO1 - 150、TechniQuip社、リバモア、CA、米国）。
  7. レーザードップラーフローメトリー（PeriFluxシステム5000、Perimed、ストックホルム、スウェーデン）。
    1. フレキシブルマイクロチップ（MT B500 - 0ストレートマイクロチップ、Perimed、ストックホルム、スウェーデン）
  8. 温度パラメータ：
    1. 直腸温度のモニター（BAT - 12、世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州）。
    2. サーマルブランケット（T / PUMP、TP600、Gaymar、NY、米国）。
  9. 染色とボリュームの梗塞の定量的測定：
    1. 2％溶液2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム（2％TTC、シグマ - アルドリッチ社、セントルイス、MO、米国）。
    2. マウス脳行列スライサ​​ー（Zivic - ミラーラボ。、（株）、アリソンパーク、PA、米国）。
    3. デジタルカメラ（V1253、コダック（株）、ロチェスター、NY、米国）。
    4. 画像Jソフトウェア（ImageJの1.42qソフトウェア、米国国立衛生研究所、ベセスダ、MA、米国）。

2。術前のステップ

  1. 手術前に、マウスは、水とげっ歯類の餌への無料アクセスと12：12 /暗サイクル下で飼育されています。
  2. 先端径、0.20〜0.25ミリメートル; MCAO用縫合糸は、（7-0それは乾燥させること、液状シリコーンゴムとその先端から縫合シャフトの熱とコーティング3〜4ミリメートルと縫合の先端の1 - 2mmを鈍化することによって調製されるコーティングは、長さは、3〜4ミリメートル、縫合糸の長さは11〜13ミリメートル）。無菌性は、前述の手順のすべてで保存されるべきである。
  3. フェイスマスクを介してO 2、70％N 2 Oガスの混合物をマウスを秤量した後、麻酔が誘導チャンバ内のイソフルラン4％に誘導され、30％のイソフルラン1.5〜2パーセントと手順の間に維持した。
  4. マウスは、温度制御された操作面（​​サーマルブランケット）に横たわっているガーゼのパッド上に腹臥位に配置され、頭の毛を剃毛しています。
  5. 潤滑剤の眼軟膏は、両眼に適用され、まぶたは、手術過程で目の乾燥を防ぐために閉鎖されています。
  6. 正中切開（1 cm）を[後]頭骨と皮膚が貼っ柔軟なマイクロチップを（; 0.5ミリメートルの直径MT B500 - 0ストレートマイクロチップ）に横方向に引っ張られるために上項線から頭蓋冠を覆う皮膚に行われます。マイクロチップは、レーザードップラーフローメトリーによってMCA領域の血流を監視するために右頭頂葉の頭蓋骨の表面（ブレグマの後外側1mmと5mm）をするために垂直に配置されます。
  7. 動物を仰臥位になっている前に、柔軟なマイクロチップがしっかりと頭蓋骨に接続されていることを確認してください。動物の首は柔らかいパッド上に配置され、その鼻は、麻酔装置のノーズコーンに保持されます。これにより、柔軟なマイクロチップのための十分なスペースを持つことになります。
  8. 直腸温度プローブは、± 0.5 37℃の一定の動物のコア温度を維持するために挿入される
  9. 前足と後足の両方は、オペレーティングプラットフォームの表面にテープで固定されており、尾は直腸チューブにテープで固定されています。

    10. 3。 MCA閉塞の手術：

    1. 手術用顕微鏡下では、正中首の切開を穏やかたるんだ皮膚を持ち上げて、胸骨柄と顎の間にはさみで作られています。
    2. 対になった基礎と顎下腺はぶっきらぼうにその場に残された左腺で、分かれています。右顎下腺は頭側で引っ込めと胸鎖乳突筋と一緒に固定されています。
    3. 頸動脈鞘をカバーする肩甲舌骨筋の露出部門は慎重にピックアップして分かれています。
    4. 右総頸動脈（CCA）は慎重に迷走神経とその鞘（CCAの横にある）から分離し、分離されています。
    5. 以下、MCA閉塞を実行するために頻繁に使用されている2外科的方法は発散していく。

    小泉の4方式

    1. 三緩い襟縫合糸（7-0絹）は、右CCAの周りに用意されています。
    2. 外頚動脈（ECA）は、識別分離、および焼灼（2〜3ミリメートル分岐から遠位）されています。それは、その後、マイクロはさみで分割することができます。焼灼部位の不注意な周辺機器の破損を避けるために、電力は、ノブを使用して1に設定する必要があります。これは、すべてのcauterizationsに対して一貫しています。
    3. 十分な張力が血流（永久結紮）を閉塞するためにCCAの最も近位の襟の縫合糸に適用されます。流れの閉塞は、ベースライン皮質血流値の〜50％の低下によって検証されます。
    4. その後、容器のクリップは、動脈切開時の逆流を防ぐためにちょうどCCAの分岐の前に配置されます。
    5. 動脈切開は、近位結紮縫合糸とマイクロシザー（近いライゲーションまで）とCCAでの船舶のクリップの間で行われます。
    6. 熱平滑シリコンでコーティングされた7〜0ナイロン縫合糸は、動脈切開を介して導入し、それが血管クリップに達するまで進んでいる。 2残りの緩い襟の縫合はやさしく動脈壁のトラウマがない状態で、CCAを通して流れの漏れをバック避けるために、動脈切開し、血管クリップの間にCCAの周りに締められて、その後、容器のクリップが撤回される。

    ガの3方式

    1. ECAは、識別（舌と上顎動脈にその分岐の近くに）可能な限り解剖し、焼灼（1に設定電源付き）、およびマイクロハサミで分割されています。
    2. 二つの緩い襟の縫合糸（7-0絹）もCCAの分岐上に近ICAの周りに用意されています。
    3. CCAは、一時的に血管クリップで閉じられます。流れの閉塞は、ベースライン皮質血流値の〜50％の低下によって検証されます。
    4. その後、ICAは、一時的に動脈切開時の逆流を避けるために2つの緩い襟縫合上記血管クリップで閉じられます。
    5. 動脈切開は切り株に反映ECAの近くにマイクロはさみを使用して実行されます。
    6. それはICAの適用船舶のクリップに達するまで熱平滑シリコンでコーティングされた7〜0ナイロン縫合糸は、ECAと高度に動脈切開を介して導入される。近位ICAの2緩い襟の縫合糸が優しく動脈壁をトラウマに十分注意を払って、ICAを通して逆流の血流を避けるために、近位ICAの周りに締められて、その後、容器のクリップが撤回される。

    手順の残りの部分は主に収束する。

    1. 軽度の抵抗が感じられるまで遮蔽縫合糸は徐々に頭蓋底に向かって内頸動脈（ICA）によって進められている。ベースラインからの相対割合（= 80％）などの脳血流値の同時低下はレーザードップラーフローメトリーによって確認される。 2カラー縫合糸は、挿入されたフィラメントの周りに締められている。
    2. 一過性脳虚血実験では、遮蔽縫合糸は、45分後に静かに撤回されている。この時点は、種々の実験目的のために変更することができます。
    3. 縫合糸のフィラメントを撤回した後、動脈切開部位は手術後の出血を避けるために閉じている。小泉首相の手法では、これはしっかりとCCAの周り襟縫合糸を締めて行います。ガの技法では、ECAのベースにある動脈切開部位を焼灼され、その後、近位ICAで襟縫合糸が緩んと頸動脈の流れを復元するために削除されます。
    4. 切開を閉じるには、顎下腺およびSCMは、術野を介して配置されます。傷のエッジは、子宮頸部の組織接着剤と頭皮の領域で近似されています。また、吸収性縫合糸または金属主食は、動物の長期生存が意図され、特に傷を閉じるために使用することができる。
    5. 切開の閉鎖後、動物は、ボリュームの補充として皮下1ミリリットル温かい生理食塩水を受け取ります。適切な鎮痛薬の投与量（0.05〜0.1 mg / kgでつまりブプレノルフィン）は、回復期間中に動物の痛みや不快感を最小限に抑えるために使用する必要があります。魂lが手術室から削除され、柔らかい食べ物と水は自由に、簡単にアクセスして、低体温を防ぐために、暖かいリカバリ領域/ケージに入れています。

    4。術後神経学的評価

    動物は合計意識を回復した後で3を次のように、神経学的欠損は、単純な尺度（5点尺度）で評価することができます。

    1. 観察可能な赤字ない
    2. 反対側の前足（軽度の局所神経学的赤字）を拡張するために失敗
    3. 梗塞に反対方向に周回し（中等度の神経学的局所の赤字）
    4. 梗塞に対側方向に立（重篤な神経学的局所の赤字）
    5. 自発的な動きのない意識レベルの低下

    5。脳梗塞体積の染色と定量的測定

    1. MCAの再灌流の24時間後、生き残ったマウスは、4％isofloraneで深く麻酔を秤量し、そして承認されたプロトコールにしたがって犠牲に。
    2. 脳には、慎重に除去し、マウス脳マトリックススライサーに配置され、全体の大脳は、2mm間隔でcoronally切片です。
    3. セクションを2％に浸漬されているリン酸塩のTTCは、37℃緩衝食塩水（PBS）℃で20分間。 TTC染色した後、梗塞領域は赤レンガ（実行可能な）組織（図1）に隣接する白（未染色）組織として示されています。
    4. 連続切片画像のJのプログラムを使って測定されるデジタルカメラや梗塞の面積を使用して撮影している。
    5. 梗塞の領域（白、未染色）、同側半球の領域（白と赤レンガ、ステンドグラス）、および対側半球（赤レンガ、ステンドグラス）の面積は、セクションごとに測定されます。ボリュームは、すべてのセクションでは代表的な分野を合計し、スライスの厚さを乗じて計算されます。浮腫のために修正した後、梗塞の体積はFOLLOWS 9として計算されます。
      訂正梗塞体積（CIV）、％= [対側半球の体積- （同側半球の体積-梗塞体積）] /対側半球の体積× 100

    6。代表的な結果

    一過性脳虚血を確立するために、左CCAを介してMCAの閉塞および再潅流後、動物を屠殺していると、そのcoronally切片脳は梗塞（図1）の量を評価するためにTTCで染色されています。

    figure-protocol-1
    MCA閉塞を受けたマウスから図1。TTC染色シリアル冠状脳切片（2mm）を。

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ディスカッション

MCAOモデルは、マウスの種で脳虚血を複製する確立されたモデルです。このモデルは、最初にラットで使用され、その後マウスに適応されました。血液脳関門透過性と頭蓋内圧上の手術操作の影響を排除するクレイニエクトミを避けることがこの手法の利点です。しかし、このような歪関連の相違点10、閉塞6、体温12、麻酔13の縫合ヒント11、持続時間の大きさ、およびその他の要因など、多くの変数は、このモデルで梗塞体積の矛盾につながることができます。
言及を保証する特定の技術的な詳細があります。

  1. コー​​ティング縫合糸の端が減少穿孔のリスクがMCAを閉塞するため、スムーズで扱いやすい縫合が作成されます。
  2. それが誤って襟縫合に限定されないように繊細に隣接する動脈から迷走神経を分離して固定します。吸蔵縫合を昇順ながら、動脈切開を介して逆行性出血を避けるために2つのカラー糸を使用し、動脈壁をtraumatizing避けるために、穏やかにそれらを締めてください。
  3. 翼口蓋動脈は、CCAの分...

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開示事項

著者らは、利害の衝突がないことを宣言します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前タイプ会社カタログ番号コメント（省略可能）
雄のC57BL / 6マウス動物ハーランラボラトリーズ、インディアナポリス、IN、アメリカ合衆国 20から26 GRS
解剖顕微鏡顕微鏡ライカ実体顕微鏡MZ6 6.3:1ズーム
光ファイバー照明照明器 TechniQuip（株）、リバモア、CA、アメリカ合衆国 FO1 - 150
イソフルレン麻酔バクスターの医薬品、ディアフィールド、イリノイ州 1001936060
ストレートSuperCutアイリスはさみ、 手術道具世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 14218
Vannasストレート、マイクロはさみ手術道具世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 14003
デュモンファインチップの鉗子手術道具世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 503290
容器のクリップ手術道具世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 14120
高周波デシケーター900 手術道具世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 500397
7から0まで外科ナイロンモノフィラメント縫合糸縫合エチコン、（株）、サマービル、ニュージャージー州、米国 1647G 閉塞のための縫合
7から0まで外科シルク縫合糸縫合エチコン、（株）、サマービル、ニュージャージー州、米国 7733G ライゲーションのための縫合
シリコーンRTV接着剤シリコーンゴム世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 1571
Vetbond 組織接着剤 3M社、セントポール、MN、アメリカ合衆国 70200746587
Puralubeの獣医の軟膏眼軟膏 Pharmaderm、メルヴィル、ニューヨーク、アメリカ合衆国
ブプレノルフィンhydrochlorode 鎮痛薬ホスピーラ社、レイクフォレスト、IL、アメリカ合衆国 NDC 0409-2012-32
熱焼灼ユニット世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 501292
PeriFluxシステム5000 TCD流量測定法 Perimed、ストックホルム、Sweeden
BAT - 12 直腸温度計世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国 BAT - 12R
T / PUMP、TP600 サーマルブランケット Gaymar、NY、アメリカ合衆国
2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム試薬シグマ - アルドリッチ社、セントルイス、MO、アメリカ合衆国 T8877
マウス脳行列スライサ​​ー脳スライサー Zivic - ミラーラボ。、（株）、アリソンパーク、PA、アメリカ合衆国 BSMAS001 - 1

参考文献

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