方法論記事

CRISPRを介した塩基編集ツール:標的塩基置換を誘導するゲノム編集技術

2025年7月8日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:J.E.他を参照。CRISPR媒介ベースエディターを使用したBRCA1バリアントの機能評価。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、標的ヌクレオチド置換を誘導するためのCRISPRを介したシトシンベースエディターの概念を説明しています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. CRISPRを介した塩基編集ツールを用いたBRCA1変異体の作成

>注:HAP1-BE3細胞株を使用しない場合、BE3をコードするプラスミドDNAをBRCA1を標的とするgRNAと同時トランスフェクトすることができます。BE3プラスミドとgRNAプラスミドの同時トランスフェクションと比較して、HAP-BE3細胞へのgRNAプラスミドのトランスフェクションは、私たちの手の中の標的遺伝子座で最大3倍まで効率的な塩基編集を誘導します。

  1. トランスフェクションの1日前に、24ウェルプレートのウェルあたり5 x 105 HAP1-BE3細胞(または共トランスフェクション法の場合はHAP1細胞)を播種します。トランスフェクション時には、細胞を適切な密度(70%〜80%のコンフルエンス)に達するように培養します。
  2. 購入したトランスフェクション試薬(Table of Materials)を使用して、メーカーのプロトコルに従ってBRCA1を標的とするgRNAをトランスフェクションします。BRCA1標的gRNA 1 μg(コトランスフェクション法の場合はBE3コードプラスミドDNA1 μg)を使用して、BRCA1標的部位でC:GからT:Aへの変換を誘導します。細胞を37°Cでインキュベートし、3〜4日ごとに継代培養します。
  3. トランスフェクションの3日後、10日後、および24日後に細胞ペレットを回収して、塩基編集効率を分析します(トランスフェクションの3日後のサンプルは、0日目のサンプルとして再評価して分析されます)。
  4. ゲノムDNA精製キットを用いてゲノムDNAを抽出する(Table of Materials).
    注:トランスフェクション条件の最適化は、試薬とDNAの比率を可変にすることをお勧めします。HAP1トランスフェクションの最適条件は、試薬とDNAの比率が4:1であることです。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リポフェクタミン 2000 サーモフィッシャーサイエンティフィック 11668027トランスフェクション試薬
オプティMEM ギブコ 31985070トランスフェクション材料
FuGENE HDトランスフェクション試薬 プロメガ E2311 トランスフェクション試薬
イスコーブの修正ダルベッコの媒体 ギブコ 12440046HAP1細胞用培地
lentiCas9-ブラスト アドジーン 52962lentiBE3クローニングのためのプラスミドDNA
DNeasy 血液組織キットキアゲン69504ゲノムDNA調製キット

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タグ

CRISPR BRCA1 RNA DNA HAP1 BE3 Cas9

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