CRISPRを介した塩基編集ツール:標的塩基置換を誘導するゲノム編集技術

要約

出典:J.E.他を参照。CRISPR媒介ベースエディターを使用したBRCA1バリアントの機能評価。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、標的ヌクレオチド置換を誘導するためのCRISPRを介したシトシンベースエディターの概念を説明しています。

プロトコル

1. CRISPRを介した塩基編集ツールを用いたBRCA1変異体の作成

>注:HAP1-BE3細胞株を使用しない場合、BE3をコードするプラスミドDNAをBRCA1を標的とするgRNAと同時トランスフェクトすることができます。BE3プラスミドとgRNAプラスミドの同時トランスフェクションと比較して、HAP-BE3細胞へのgRNAプラスミドのトランスフェクションは、私たちの手の中の標的遺伝子座で最大3倍まで効率的な塩基編集を誘導します。

1. トランスフェクションの1日前に、24ウェルプレートのウェルあたり5 x 10⁵ HAP1-BE3細胞(または共トランスフェクション法の場合はHAP1細胞)を播種します。トランスフェクション時には、細胞を適切な密度(70%〜80%のコンフルエンス)に達するように培養します。
2. 購入したトランスフェクション試薬(Table of Materials)を使用して、メーカーのプロトコルに従ってBRCA1を標的とするgRNAをトランスフェクションします。BRCA1標的gRNA 1 μg(コトランスフェクション法の場合はBE3コードプラスミドDNA1 μg)を使用して、BRCA1標的部位でC:GからT:Aへの変換を誘導します。細胞を37°Cでインキュベートし、3〜4日ごとに継代培養します。
3. トランスフェクションの3日後、10日後、および24日後に細胞ペレットを回収して、塩基編集効率を分析します(トランスフェクションの3日後のサンプルは、0日目のサンプルとして再評価して分析されます)。
4. ゲノムDNA精製キットを用いてゲノムDNAを抽出する(Table of Materials).
   注:トランスフェクション条件の最適化は、試薬とDNAの比率を可変にすることをお勧めします。HAP1トランスフェクションの最適条件は、試薬とDNAの比率が4:1であることです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リポフェクタミン 2000	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11668027	トランスフェクション試薬
オプティMEM	ギブコ	31985070	トランスフェクション材料
FuGENE HDトランスフェクション試薬	プロメガ	E2311	トランスフェクション試薬
イスコーブの修正ダルベッコの媒体	ギブコ	12440046	HAP1細胞用培地
lentiCas9-ブラスト	アドジーン	52962	lentiBE3クローニングのためのプラスミドDNA
DNeasy 血液組織キット	キアゲン	69504	ゲノムDNA調製キット