生きた動物の中で幹細胞の分化を研究するための魅力的なモデルは、プラナリア扁形動物です。再生は簡単に基本的な実験室で行われる単純な切断実験により研究し、薬理学的および遺伝的（に適しているさ in vivoで RNAi）は、この記事ではプロトコルで詳述するように操作。
この記事について
サマリー
要約
自由生活プラナリアの扁形動物は彼らの驚くべき再生能力を1から実験的な利用等により、長い歴史を持っている。これらの動物から摘出された小さな断片が欠落しているボディ構造の再生に続くオリジナルのボディプランを改革。 "トランク"の断片がそのままワームから切断されている場合、例えば、新たな"頭は"前方に生成されると"尾"は（ 図切断する前の元のボディ構造の"頭部と尾部"極性を復元後方に再生成されます1A）。
再生は通常の身体の恒常性と強制組織の再生中に〜30の異なる細胞型に分化"neoblasts"として知られるプラナリア幹細胞、によって駆動されます。この再生過程では、実証するため、強力かつ簡単です。いくつかの先駆的なラボの献身のおかげでは、多くのツールと機能的遺伝学的手法は、現在このモデルシステムに最適化されています。その結果、かなりの最近の進展は、プラナリアの発達可塑性2-9を支える分子事象を理解し、操作で行われている。
プラナリアのモデルシステムは、科学の広い範囲に興味を持ってもらえるでしょう。神経科学者のために、モデルは単純に全体の神経系の再生ではなく、通常は多くの確立されたモデルでの研究の焦点となっている単一の神経細胞のプロセスの再生/修復を勉強する機会を与えてくれます。プラナリアは、神経伝達物質10の茄多を表現する中枢神経系11、12の進化を研究するための重要なシステムを表しており、行動のスクリーニングの可能性13、14を持っている。
再生結果は、薬理学的および遺伝的apparoachesによる操作に適している。例えば、薬は単に切断後の異なる時点で薬剤を含む溶液中で身体の断片を配置することによって、再生への影響についてスクリーニングすることができる。個々の遺伝子の役割は、マイクロインジェクションのサイクルを介して、または細菌で発現された二本鎖RNAの構造8、9、15を供給することにより、どちらかを達成することができるノックダウン方式（ 生体 RNAi の ）、使って研究することができます。どちらのアプローチは、バイポーラの動物16から21までの高い浸透率、たとえば、再生時に視覚的に印象的な表現型を生成することができます。このようなメソッドのこのモデルと実装の 採用を促進するために、我々はプラナリアDugesiaはジャポニカ使用して薬理学的および遺伝学的ア ッセイ（in vivoでのRNAi の摂食による）のためのこのビデオの記事プロトコルで披露。
プロトコル
1。トランクのフラグメントの再生アッセイ
- 動物を確保するために再生アッセイ前に少なくとも5日間ワームのコホートを供給停止は、廃棄物や摂取した食べ物（〜30そのままワーム、それぞれのワーム〜8〜10ミリメートル長いポスト飢餓）は無料です。
- 検定の日に、水で事前に冷凍水平に氷皿を洗い、ラップで平らなアイス表面を覆う。鉗子を使用して、ラップで1つろ紙を置きます。
- 春の数滴の水でろ紙を湿ら。トランスファーピペットを使用して、フィルタ（フィルタあたり<20ワーム）の上にプラナリアを転送します。ワームは、より多くの温泉水でrepipettingで、必要に応じて、フィルタを再配置することができます。余分な水分を取り除きます。
- メスを使用して、動物や咽頭の前端（ 図1A）の前方頂点間のほぼ中間に作られたシングルカットで頭部を切断する。
- メスを使用して、約半分尾の動物の終わりと咽頭（ 図1A）の後端との間に作られたシングルカットで尾部を切断する。カットした後70％エタノールで湿らせたペーパータオルを使用してメスで余分な粘液を取り除く。メスから余分なエタノールを拭きます。
- 春の水を含むペトリ皿（100 × 25ミリメートルの深さ）にピンセットを介してフィルタを転送する。 （創縫合のための、傷のピンチと暗くによる観測）〜3分間待ちます。
- ろ紙からの回生アッセイと恒温インキュベーターへの転送（24℃）の所望の培地を含むペトリ皿にトランクの断片をすすぎます。
- 再生の構造は（ 図1A）識別可能〜1週間後にスコアが再生表現型、。
2。プラジカンテルにより誘導される二極化：再生の薬理学的操作
- DMSOに可溶化薬剤（200mmの株式に対して1mLので62.4mg PZQ）によってプラジカンテル（PZQ）株式を準備します。同じ日に使用してください。
- バッファMontjuch塩の薬物含有溶液（90μMPZQ）の50mLのを確認。分散性を確保するために〜1分間ボルテックス。
- 最後のステップ[1.7]でPZQにトランクのフラグメントのコホートを公開する、[プロトコル＃1]上記の詳細として、トランクの断片回生アッセイを実行します。
- 24-48時間後に、交換PZQ含有、湧水のためのメディアをワームのいくつかの（> 3）回洗浄。
- インキュベーターにワームを返します。スコアの二極化（二頭、 図1B）切断後一週間。
3。再生の遺伝子操作：in vivoでのRNAi送りプロトコルで
- アッセイ前に、鶏の肝臓ホモジネートを準備。 foodstockから脂肪、黄色のセクション、ピューレ、残りの肝臓を捨てる。ストレージのためのメッシュのストレーナー、アリコートの懸濁液（1.5mlのチューブ、-20 ° C）を介してフィルタピューレ。
- アッセイ前に、-20℃で保存され、1mLの試料に供給を小分けでウシ赤血球（RBC）を準備する
- RNAiのワームを選択します。 3つのコホートが使用されています：目的の遺伝子、ポジティブコントロール（既知のRNAi表現型を有する遺伝子; 図1C、D＆E）とネガティブコントロール（無RNAiの表現型を有する遺伝子、実験的なコホートと比較してノックダウンレベルの評価にも有用）。各コホートの場合は、〜250ワームを（少なくとも5日間飢え後に長い〜8〜10ミリメートル）を使用します。プラスチック製の浴槽で温泉水に保管してください。
- 興味のdsRNA標的遺伝子を発現する大腸菌の各RNAiコホート、雪解けストックの[8]、鶏の肝臓ホモジネートのチューブと一緒に[3.1]と赤血球のチューブ[3.2]。
- ペレット細菌（13,000 G、1分）。 2xYTメディア（〜700μl）で上清とペレットを再懸濁しますを削除します。 Recentrifugeは、氷の上清、場所ペレットを捨てる。
- チップの先端をカットすることで大口径P200のピペットチップを作成します。徹底的にRNAiの供給ミックスを作成するために鶏肝臓ホモジネート（150μL）と赤血球（50μL）の混合物で、細菌ペレットを再懸濁します。遠心により気泡を取り除きます。
- 給餌の場合は、ワームを（〜1インチの深さを残す）を含むプラスチックの浴槽からの水の大部分を取り除く。このコンテナの中心にワームを集中させるスワール浴槽、およびワームをcorralling円でピペットのRNAi給餌ミックス。慎重に他の食事を乱すことなく、RNAiの給餌ミックスに戻って脱出を同軸ケーブルに転送ピペットを使用してください！
- 給餌（〜1時間）した後、よく飼育プラナリアを識別する。これらのワームは、摂取した赤血球から深い赤の着色を示す。他人を捨てる。
- 慎重に、新鮮な湧き水を使用してソリューションを供給する食品の排せつ物を防ぐために、妨害を最小限に置き換えます。これを行うには、静かに濁った水を注ぐ、転送ピペットを用いてチューブの片側にワームをローカライズし、慎重に新鮮な水で置き換えるには、浴槽の反対側の壁を注いだ。再び潜水するのプラナリアは、すぐに空気に長時間さらされるとしても、食品の排せつ物をもたらす。
- 疎SEらの容器のふたやインキュベーターに復帰（24 ° C）
- 再生サイクル[プロトコル＃1]のRNAi表現型をスクリーニングするためのを織り交ぜ、複数のサイクルにわたるRNAiの給餌プロトコル（離れて2〜3日間）、繰り返します。多くの遺伝子のための効果的な給餌と再生のための標準プロトコルは、継続時間の合計で1ヶ月〜かかる図2に示されています。
最適なプロトコルはこのようなmRNAの安定性、組織局在性、タンパク質のperdurance、または再生後に複数の給餌サイクルを排除する表現型の開発などの要因に左右されるように、異なる遺伝子のためにこのスキームを変更します。単にネガティブコントロールのコホートで標的mRNAレベルを比較する表現型の浸透率（見かけの場合）のため、または定量PCR手法でスクリーニングすることによって、ノックダウンのレベルを評価する。
4。代表的な結果：
トランクのフラグメントの再生アッセイでは、すべてのワームは、通常の前後（"尾に頭'）極性で再生成する必要がありますように堅牢です。これは、前eyespotsの出現（asterixed、 図1A）により促進、カットした後五日するとすぐに得点することができます。しかし、失われた構造物の完全な形態学的な復元は一週間後に発生します。双頭のワームを得るためにPZQによるトランクの断片の再生の薬理学的操作（ 図1B）も堅牢である（EC 50 = 87（+ - ）11％バイポーラフラグメント、48時間2070μMPZQ）。二極化は、単一の再生サイクルを介して行われます。これらのアッセイの下の有効性は、おそらく薬の溶解性および/またはストレージに関する問題、またはPZQは効果がない別の扁形動物の種の使用にも関する。低浸透率を有する薬剤の場合は、anteriorizationのインデックスは、多くの場合、完全な二極22から脇の中間表現型を獲得するために使用されます。正の制御構文のRNAi実験に起因する表現型を図1に示されています： ニホンDugesiaのRNAi 六1（D J六- 1）目のない表現型23（ 図1C）、Dugesia ジャポニカPC2のRNAi（DJ - PC2）の結果光嫌悪反応24（ 図1D）とのRNAiの損失の結果Dugesiaスギβcatenin- 1（DJ -βcatenin- 1）トランクのフラグメント（ 図1E）から双頭の表現型16-19、21の結果。これらの表現型は、次のような単純なRNAiのプロトコルを使用して達成することができます：DJ -六1（FFxFx）、DJ - PC2（FFFx）、DJ -βcatenin- 1（FFxFx）、ここで、F =給餌サイクルとx =再生サイクルそれぞれ。
図1：トランクのフラグメントの再生アッセイ左 、プラナリアの画像（上）と回路図（中央）切り出したトランクのフラグメントの位置を示すために右 、指示された時間（日数）で再生フラグメントの外観を示すトランクのフラグメントの再生のtimecourse B。。。 PZQの曝露によって生成される。双頭のプラナリアの画像DJ -六1のRNAi。モバイルコントロールのワームに比べて不動のDJ - PC2のRNAiワーム（ステンドグラス赤）の光嫌悪反応のDの損失、（ステンドによって生成されたC'目のない"ワーム緑）。Eバイポーラプラナリアは、DJ -βcatenin- 1 RNAiにより作り出した。 BEで、RNAiはワームのオリジナルの前端には、左に指向です。
図2：D.における多くの遺伝子のノックダウンに有効である、複数の栄養（F）、及び再生サイクルを構成する典型的なRNAiのプロトコル（x）の供給と切断サイクルのシーケンスジャポニカ 。個々の遺伝子のためのこのプロトコルの変更が少ない（括弧）や給餌と再生のサイクルのより大きい数を使用する例については、最適な結果を得ることが必要になることがあります。
ディスカッション
プロトコルは、 ジャポニカプラナリアDugesiaの再生を研究し、操作するためここに詳細のアッセイを説明した。彼らは単純なものであり、それらは容易に実験室や教室で行うことができるというような特殊な機器を必要としません。アッセイは個別に実行、または組み合わせて（in vivoでの薬物の効能の化学遺伝学的スクリーニングのための）と候補遺伝子レベルで行うことができる、または公正な、より高いスループットスクリーニング8に適応可能であることができる。自分の右側にプラナリアの興味深い生物学を研究するためかどうか、または組織再生を研究するための代替モデルの哺乳類ホモログの in vivo機能で評価するために、これらのアプローチは、研究者の多様な範囲からの関心を触媒してください。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
ラボでの作業は、NSF（MCB0919933）とNIH（GM088790）によってサポートされています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | ベンダ | カタログ番号 | コメント |
| 春の水 | Kandiyohi。プレミアムウォーターズ株式会社ミネアポリス、ミネソタ州 | N / A | 温泉水の他の形態も良好に動作します。生存率アッセイで初の試み。 |
| 塩化ナトリウム（1.6mm厚）、塩化カルシウム（1mMの）、硫酸マグネシウム（1mMの）、MgCl2の（0.1）、塩化カリウム（0.1）、NaHCO3水溶液（さ1.2mm）、HEPES（1.5mmの）：1 xは、モンジュック塩をバッファ。 24でpH7.4の℃の | 複数のベンダー | N / A | pH緩衝性を確保するために再生アッセイ中の薬物治療のための人工的な水。 5月8日Holtfreterのソリューションは、代替手段です。 |
| 2xYT培地 | フィッシャーサイエンティフィック | BP2467 - 500 | メディア= 31グラム/ L。オートクレーブ。 |
| ペトリディッシュ（100x25mm） | フィッシャーサイエンティフィック | 08-757-11 | 再生サイクルの間に住宅のワーム |
| スクエアディッシュ（100x100x15mm） | フィッシャーサイエンティフィック | 08から757 - 11A | ワーム切断面として使用される製氷皿に水、凍結で埋める |
| プラスチック製の浴槽：ジップロックツイスト'N LOC（16オンス）。 | 様々な小売業者 | N / A | RNAiのコホートに便利な防水容器 |
| 鶏のレバー | 商業用食料品 | N / A | 抗生物質の回避により、有機供給に向けてバイアス、。 |
| ハンドブレンダー | あらゆる台所のサプライヤー | N / A | 鶏レバーのピューレを作るために使用 |
| ワイヤー1ミリメートルメッシュストレーナー | あらゆる台所のサプライヤー | N / A | 鶏レバーのピューレに負担をかけるために使用 |
| ウシ赤血球 | Lampire生物研究所 | 7240807 | 100パーセントRBC懸濁液を洗浄し、プール |
| 円形のろ紙 | ワットマン＃3 | 1003 055 | |
| 注入器 | フィッシャーサイエンティフィック | 13-711-41 | |
| 滅菌、外科ブレード | 複数のベンダー | N / A | |
| ±プラジカンテル | シグマアルドリッチ | P4668 | 4℃で暗所に保管して粉体のアリコート℃の生気を奪う。 |
| DJ六- 1 | GenBankのAJ557022.1 | "目のない"表現型は23 RNAi実験のポジティブコントロール | |
| DJ -βcatenin- 1 | GenBankのAB181913.1 | 双頭の表現型17のRNAi実験のポジティブコントロール | |
| DJ - PC2 | 羞明の表現型24の損失のためのRNAiのポジティブコントロール |
参考文献
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