マウスにおけるヘリコバクター感染制御のための胃内強制猶予法

要約

出典:D'Costa, K. et al., ヘリコバクター感染と胃の病状のマウスモデル。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、マウスモデルでの胃内強制薬技術によるヘリコバクターピロリ感染の確立を示しています。細菌懸濁液は、口から胃に挿入されたカテーテルを介して投与されます。接種された細菌は、胃にコロニーを形成して感染を確立するため、宿主と病原体の相互作用を研究するために使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細菌性接種菌の生育と調製

1. ヘリコバクター・ピロリ菌(H.ピロリ菌)またはH.フェリスのグリセロールストックを-80°Cから解凍し、馬の血液寒天培地(HBA)プレートで培養を行ないます:血液寒天培地No.2(材料の表を参照)、改良された「Skirrowの抗生物質選択的サプリメント」(バンコマイシン、10μg/mL、ポリミキシンB、 25 ng/mL;トリメトプリム、5μg/mL;アムホテリシンB、2.5μg/mL);5〜10%(V / V)の馬の血液。細菌は、適切なガスパック(材料の表を参照)が入った2.5または3.5Lの嫌気性ジャーで、37°C.
   で、マイクロ好気性条件下でよく増殖します 注:これらの条件下で増殖したピロリ菌株は、1〜1.5日間のインキュベーション後に継代培養する必要がありますが、ヘリコバクターフェリスの場合、一般的に少なくとも2日間のインキュベーションが必要です。適切な培養および保存培地については、以前に詳細に説明されています。
2. マウス感染に対する細菌接種物は、初期から中期の対数期培養液から調製します。寒天プレートからバクテリアを穏やかに採取し、各プレートに1〜2 mLの脳心注入(BHI)ブロスを浸します。パスツールピペットでプレートから懸濁液を吸引します。
   1. あるいは、BHIブロスで16〜18時間増殖したヘリコバクター細菌から接種物を調製します。この場合、2,200 x gで4°Cで10分間低速遠心分離することにより、細菌を回収します。
3. 位相差顕微鏡(100倍対物レンズ)でウェットマウント調製物を調べることにより、細菌の生存率と運動性を評価します。ガラス顕微鏡スライド上の10〜20 μLのBHIブロスの液滴にループ状の細菌を再懸濁することにより、ウェットマウントを調製します。H. felisは、H. pyloriよりもはるかに大きな細菌であるため、血球計算盤を用いて生菌の数を正確にカウントします。グラム染色を行うことにより、培養純度を確認します.
   手記：H. pylori inoculaは、大部分の細菌が細菌状またはらせん状である場合にのみ使用してください(形態は菌株によって異なります)。 H. felis inoculaは、主にらせん状の細菌を含む必要があります。ほとんどの細菌が球菌様の形態を持っている場合は、これらの形態が生存可能ではなく、マウスで感染を確立しないため、接種剤を使用しないでください。
4. 接種材料中の細菌の数を推定するには、位相差顕微鏡でフィールドあたりの細菌数のおおよその数をカウントし(100倍対物レンズ)、次のガイドを使用します:フィールドあたり1つの細菌=ヘリコバクター/mLの約10⁶コロニー形成単位(CFU);フィールドあたり10個のバクテリア=約10⁷ CFU/mL;フィールドあたり100個のバクテリア=約10⁸ CFU/mL、等。
   1. 血球計算盤を使用する場合は、次の式を使用してCFU/mLを計算します:
      CFU/mL = (4 x 4 フィールド内の細菌の平均数) x (希釈係数) x (10⁴)。
5. 必要に応じて、BHIブロスで希釈することにより、接種の細菌細胞密度を約10⁷–10⁸ CFU / mLに調整します。
   1. 細菌の生存率を最大限に高めるために、調製後できるだけ早く胃内強制経口投与用の接種剤を使用してください。.
   2. ヘリコバクター・ピロリ菌の密度と生存率を必ず確認するために、強制手術の直後に接種菌の生存率を計数してください(下記参照)。これは、H. felisの場合、通常、培養培地上で孤立したコロニーを形成しないため、常に可能であるとは限りません。接種中の生存ヘリコバクターの数は、この方法では生存可能な細菌(すなわち、細菌/スパイラル/ヘリカル)と生存不可能な細菌(すなわち、球菌)を区別しないため、光学密度測定(A₆₀₀)だけでは決定できません。
   3. 接種中の生存率ピロリ菌の数を推定する手段として光学濃度値を使用しますが、この場合、最初に成長曲線を生成する必要があります。このために、H. pylori 培養物の A₆₀₀ 値を経時的に監視し、プレート計数によって決定される生菌の数と直接相関させます。
      手記：このような成長曲線測定を行うための便利な方法は、10%_CO2インキュベーターに入れた標準的な平底組織培養フラスコを使用して、液体培地(セクション1.2)で細菌を培養することです。次に、2〜3日間にわたって4〜6時間ごとに得られた培養物のアリコートから決定されたCFUの数を、対応するA₆₀₀値と比較します。重要なことは、ピロリ菌株ごとに異なる速度で成長する可能性があり、さらに、すべての菌株が10%_CO2で良好に成長するとは限らないため、成長曲線を生成する必要があります。

2. ヘリコバクターを用いたマウスの胃内強制経口

投与

>注:この胃内強制疎塞の方法は、腸内にコロニーを形成する他の細菌種、例えばS.チフス菌、C.げっ歯類、リステリア

菌に適用できます。

1. 6〜8週齢の特異的病原体を含まない(SPF)およびヘリコバクターを含まない雄または雌のマウスを使用してください。C57BL/6遺伝的背景を持つ動物を、H. pyloriまたはH. felisの感染実験に用いてください。本研究では、主要な自然免疫受容体を欠損した野生型(WT)マウスおよび遺伝子改変C57BL/6マウス(ノックアウトマウスまたはKOマウス)を用いた
   手記：他の遺伝的背景を持つマウスもヘリコバクター感染症に使用できますが、コロニー形成レベルと疾患の重症度は、宿主の背景の種類によって影響を受ける可能性があります。
2. 細菌接種物(ステップ1.5)を使い捨ての1mL注射器に吸引し、付属の針を使い捨てポリエチレンカテーテル(長さ、6〜8 cm、内径、0.58 mm)が貼り付けられた23ゲージの針と交換します。.プラスチックフィルムの小さなストリップを貼り付けて、カテーテルを針に固定します(材料の表を参照)。または、滅菌プラスチック栄養チューブ(20ゲージx 38 mm)を使用して、針/カテーテルアセンブリを交換します。
3. 首筋と尻尾をしっかりと握ってマウスを物理的に拘束します
   手記：この手順は、麻酔なしで、またはメトキシフルランやイソフルランなどの吸入麻酔薬を使用して実行できます。
4. 開いた顎の中央にカテーテルを挿入し、食道に向かって尾側方向に導きます。マウスの首を伸ばして、食道から(および気管から離れて)胃にアクセスしやすくし、カテーテルのほとんどまたは全部が見えなくなり、胃の基部に対応する抵抗が感じられるようにします。特定のアリコート、通常は接種ごとに100μLを送達します(図1).
   手記：マウスは、最適なコロニー形成と疾患の病理を確保するために、≥^{10 5} CFUで強制する必要があります。

結果

図1:経口強制経口投与法を示す画像。 使い捨ての1mLシリンジとフレキシブルカテーテルを使用して、胃内経路を介してマウスに≥10⁵ CFUの細菌接種を送達します。マウスはメトキシフルランを使用して麻酔をかけられ、首をしっかりと握りしめ、カテーテルが食道を介して胃にアクセスできるようにしました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細菌学的試薬
オキソイド血液寒天培地 No.2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CM0271B	滅菌前に脱イオン水に溶解してください
プレミアム除細動馬の血	オーストラリアの倫理的生物製剤	PDHB100
バクトブレインハートインフュージョンブロス	BDバイオサイエンス	237500	滅菌前に脱イオン水に溶解してください
CampyGen ガスパック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CN0025A CN0035A
その他の試薬
メトキシフルラン(ペントボックス)	メディカル・デベロップメント・インターナショナル	該当なし
機器とプラスチック製品
オキソイド嫌気性ジャー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	HP0011/HP0031
COPANパスツールピペット	インターパスサービス	200CS01
エッペンドルフ5810R遠心分離機			バクテリアペレットを2,200rpmで遠心分離し、4°Cで10分間回収
23g精密グライドニードル	BDバイオサイエンス	301805
パラフィルムM	ベミス、VWR	PM996
Portexファインボアポリエチレンチューブ	スミスメディカル	800/100/200
プラスチック製栄養カテーテル	インステック研究所	FTP20-30
1 mlツベルクリンルアースリップ使い捨てシリンジ	BDバイオサイエンス	302100
Eppendorf micropetle for 1.2 - 2 mL tubes(エッペンドルフマイクロペストル 1.2 - 2 mLチューブ用)	シグマ・アルドリッチ	Z317314	胃の均質化に使用されるオートクレーブ可能なポリプロピレン乳棒
滅菌プラスチックループ	LabServ	LBSLP7202

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