トランスフェクションされた哺乳類細胞のバッチ過剰増殖培養による抗体産生

要約

出典:Elgundi, Z. et al., Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.J. Vis. Exp.(2017年)

動画では、安定的にトランスフェクションした哺乳類細胞を用いて抗体医薬を作製する方法を実演しています。トリプトンの補給は細胞分裂を刺激し、その結果、過剰増殖を引き起こし、より高い抗体収量をサポートします。抗体含有培地は、回収され、ろ過され、さらなる使用のために保存されます。

プロトコル

>注:このプロトコルには、適切な哺乳類の発現ベクトルを使用する必要があります。ここでは、2つの発現カセットを含む単一のコンストラクトが使用されます(すなわち、重鎖および軽鎖の発現は別々のプロモーターによって駆動されます)。トラスツズマブの重鎖および軽鎖は、以前にベクターにクローニングされています。このベクターは、Andrew Beavil氏からの寄贈で、非営利のプラスミドリポジトリを通じて入手しました。

1. ベクターDNAの回収とスケールアップ

>注:ベクターDNAは、大腸菌XL-1ブルー株の軟寒天刺し培養として受け取られました;ベクターはハイグロマイシン耐性を持っています。

1. 滅菌接種スタブまたはループをスタブ培養物の軟寒天に挿入し、次いで75μg/mlのハイグロマイシンで調製したLuria Bertani(LB)寒天プレートを単離コロニー用にスリークします。プレートを37°Cで18〜24時間インキュベー
トします。
2. 1つのコロニーを75μg/mlのハイグロマイシンを含む5mlのTerrificブロス(TB)に接種します。培養物を37°Cで18〜24時間インキュベートし、225rpmで振とうします。
3. 一晩培養してベクターDNAのグリセロールストックを調製するには、800 μlの培養物と200 μLの80%グリセロールを凍結バイオアルで穏やかに混合し、-80 °Cで凍結します。
   1. バッフルシェーカーフラスコ(1/1,000希釈)に75 μg/mlのハイグロマイシンを含む100 mL TBに、100 μlの一晩培養液を加えます。培養物を37°Cで18〜24時間、225rpm振とうしながらインキュベートします。
4. 一晩培養した後、製造元のmidi/maxi調製キットの指示に従ってデオキシリボース核酸(DNA)を抽出し、精製します。ただし、次の例外があります。最終ステップでは、DNAを水(pH 7.0-8.5)で溶出または再懸濁してください。
5. 260nmおよび280nmの吸光度測定値でDNAの濃度と純度を確認し、DNAを-20°Cで保存します><。 注:オプション(強く推奨):ベクター特異的プライマーを使用してDNAを配列決定し、同一性を確認します。

>2. HEK-293細胞の安定トランスフェクション

1. HEK-293細胞(浮遊細胞)を標準プロトコルに従って増殖させ、Erlenmeyerフラスコに0.1%非イオン性界面活性剤を添加した無血清培地で維持します。2 x 10⁵細胞/mLに維持し、4日おきに継代培養します。細胞を37°Cで5%の二酸化炭素(CO₂)と120rpm回転で培養します。
   注:細胞は、トランスフェクションの4日以上4週間前に培養されている必要があります。血清含有培地中で単層として増殖したHEK-293細胞も、この手順に使用できます。
2. トランスフェクションの前日に、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加した2 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の12ウェルプレートのウェルにHEK-293細胞を3 x 10⁵細胞/mlで播種します。トランスフェクション当日は、細胞の密度が80〜90%に達していることを確認してください
3. トランスフェクション培地でDNAとポリエチレンイミン(PEI)を別々に希釈し、それらを混合します。
   1. 1ウェルあたり1.25 μgのベクターDNA (12ウェルで15 μg) を300 μlのトランスフェクション培地で希釈します。室温で5分間インキュベートします。
   2. 2.5 μl の 1 mg/ml PEI 溶液 (12 ウェルで 30 μl、つまり DNA と PEI の比率が 1:2) を 300 μl のトランスフェクション培地で希釈します。室温で5分間インキュベートします。
   3. 希釈したDNAを希釈したPEIに加え、静かに混合し、室温で15分間インキュベートします。
4. 50 μlのDNA/PEI混合物をプレートの各ウェルに滴下します。プレートを穏やかに揺さぶってトランスフェクション混合物を分散させ、プレートを37°C、5%CO₂で24時間置きます。
5. ウェルあたり50 μg/mlのハイグロマイシンBを添加し、プレートを37°C、5%CO₂に10日間戻します
   注:10日目までに、トランスフェクションされていない細胞は死滅し、プレートの表面から剥離しますが、安定してトランスフェクションされた細胞は生存可能になり、プレートに付着します。
6. ウェル内の培地を1/4容量の無血清培地と3/4容量DMEMに10% FBSを添加したもの(すなわち、0.5 mLの無血清培地+ 1.5 mL DMEM = 7.5%の最終血清濃度)と交換し、4日間インキュベートします。
7. ウェル内の培地を1/2容量の無血清培地と1/2容量のDMEMに10% FBSを添加したもの(すなわち、1 mLの無血清培地+ 1 mL DMEM = 5%の最終血清濃度)に交換し、4日間インキュベートします。
8. ウェル内の培地を3/4容量の無血清培地と1/4容量DMEMに10% FBSを添加したもの(すなわち、1.5 mLの無血清培地+ 0.5 ml DMEM = 2.5%の最終血清濃度)と交換し、4日間インキュベートします。
9. ウェル内の培地を、0.1% 非イオン性界面活性剤 (すなわち、最終血清濃度 0%) を添加した 2 mL の無血清培地と交換し、4 日間インキュベートします
   注:無血清適応中は、細胞に対する50μg/mlのハイグロマイシンB選択圧を維持してください。無血清培地に適応した細胞は、ウェルの表面から剥離し、懸濁液中に集まることがあります。50 μg/mLのハイグロマイシンBを追加添加した培養条件については、ステップ2.1を参照してください。
10. ピペットを使用して、12ウェルプレート内の懸濁培養物を穏やかに混合し、細胞を別のチューブにプールします。
    1. 血球計算盤を使用して、プールされた細胞を列挙し、30 mLの無血清培地にセインし、Erlenmeyerフラスコに2 x 10⁵細胞/mlで細胞を37°Cで培養し、5% CO₂および120 rpm回転させます。サブカルチャーと4日ごとに拡大します。
11. 液体窒素中での凍結保存のために、1 x 10⁷細胞/バイアルで10バイアルを得るために、必要な細胞密度まで培養サイズを拡大し続けます。10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む無血清培地で細胞を凍結します。
    注:抗体を含むコンディショニング培地は、各継代培養で回収してタンパク質産生を確認したり、精製条件を最適化するために使用することができます。馴化培地を回収し、継代培養用の細胞を維持するには、培養物を300 x gで5分間遠心分離し、0.22 μmフィルターで上清をろ過滅菌します。ろ過された上清は、4°Cで1〜2週間、または-20°Cで長期保存することができます。

3. バッチオーバーグローカルチャーによる大規模抗体生産

>注:抗体産生は、ステップ2.11から追跡でき、既存の細胞は、セットアップするバッチオーバーグローカルチャーボリュームに基づいて必要な細胞密度に拡大されます。そうでなければ、凍結保存から解凍された細胞は、適切な細胞密度と体積に増殖すると、この段階で始まります。抗体産生を最適化するために、さまざまな培養サプリメントを使用することができます。抗体の収量を増加させるためのトリプトンの使用は、このプロトコルで実証されています。

1. 2つの三角フラスコ中の100 mLの無血清培地に2 x 10⁵細胞/mLで細胞を播種します(非添加培養と栄養添加培養からの抗体収量を比較するため)。37°C、5%CO₂、120rpmで培養します。
2. 24時間後、トリプトンを最終濃度0.5%まで栄養補給した培養液に加えます。無添加の培養液の量を無血清培地で均等化します。
3. 8日目から、血球計算盤を使用して培養物の細胞数を毎日実行し、細胞生存率を監視します。細胞の生存率が80%未満になったら、培養上清を採取します。
   1. 培養物を3,000 x gで15分間遠心分離して上清を回収し、0.22 μmのフィルターで上清(抗体を含む)をろ過滅菌します。上清を4°C(短期)で保存するか、-20°C(長期)で凍結します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pFUSEベクトルシリーズ	該当なし	インビボジェン	重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を別々のベクターで発現させ、コトランスフェクションが必要です。
mAbXpress ベクトル シリーズ	該当なし	ACYTE Biotech Pty Ltd.(英語)	重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を別々のベクターで発現させ、コトランスフェクションが必要です。参照:Jones, M. L. et al.組換えモノクローナル抗体のライゲーションに依存しない迅速な再フォーマットのための方法。J イムノール法。354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1ベクター	該当なし	該当なし	重い抗体遺伝子と軽い抗体遺伝子は、それぞれ1つのベクターで別々のプロモーターによって駆動されます。参照:Dodev, T. S. et al.リコンビナント抗体の迅速なクローニングと発現のためのツールキットです。Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GSベクトルシリーズ	該当なし	ロンザ	重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を共発現し、単一の転写産物として翻訳したマルチシストロンベクター。
マルチシストロニックベクトルシリーズ1	該当なし	該当なし	重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を共発現し、単一の転写産物として翻訳したマルチシストロンベクター。参照:Li、J.他。組換えIgG抗体の哺乳類発現に関するさまざまなベクターデザインの比較研究。J イムノール法。318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
マルチシストロニックベクトルシリーズ2	該当なし	該当なし	重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を共発現し、単一の転写産物として翻訳したマルチシストロンベクター。Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell linesを参照してください。Jバイオテクノール。157, 1, 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-トラスツズマブ-IgG1/κ	61883	アドジーン	トラスツズマブ抗体遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子を含む哺乳類発現ベクター;pVITRO1-トラスツズマブ-IgG1/κはAndrew Beavilからの贈り物であった。
Fast-Mediaハイグロ寒天培	FAS-HG-Sの	Jomarライフリサーチ	75 μg/mlのハイグロマイシンを含む低塩LB寒天培地の調製に使用します。
ファストメディアハイグロTB	FAS-HG-Lの	Jomarライフリサーチ	75 μg/mlのハイグロマイシンを含む低塩TBブロスの調製に使用します。
グリセロール、BioXtra、≥99%	G6279	シグマ・アルドリッチ	水とオートクレーブで80%に調製します。室温で保存してください。
Jestar 2.0/LFUプラスミドマキシキット	G221020	アストラルサイエンティフィック	プラスミドMaxiプレップキット;DNAを水(pH 7.0-8.5)で溶出または再懸濁します。
FreeStyle 293-F セル	R790-07	ライフテクノロジー	無血清培地での懸濁培養に適応したHEK-293細胞株。
FreeStyle 293 エクスプレッション メディウム	〒12338-018	ライフテクノロジー	293-F細胞株を維持し、高タンパク質発現のために特別に調製された無血清培地。
コリファーP188	K4894	シグマ・アルドリッチ	非イオン性界面活性剤、プルロン酸F-68、水中で10%まで調製し、0.22μmフィルターでろ過滅菌。4°Cで保管してください。
DMEM, 高グルコース	11995年065月	ライフテクノロジー
熱不活化ウシ胎児血清	10082-147	ライフテクノロジー
ポリエチレン、リニア、MW 25,000	23966	株式会社ポリサイエンス	1 mg / mlを水に調製します。.1 M HClでpH 7.0に調整し(溶液が透明になります)、0.22 μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。使用するまで-80°Cで保管してください。
OptiPro SFMの	12309-050	ライフテクノロジー	トランスフェクション製剤の無血清培地
ハイグロマイシンB溶液	アリ-HG-1	Jomarライフリサーチ
ジメチルスルホキシド(DMSO)	AJA2225	サーモフィッシャーサイエンティフィック
トリプトン(カゼインペプトン)	LP0042B	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PBSで20%に調製し、0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。4°Cで保管してください。
BLItzシステム	45〜5000	フォルテビオ	バイオレイヤー干渉法(BLI)測定に使用される装置です。

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