ヒト神経前駆細胞をニューロンに分化させるための共培養技術

要約

出典:Su, C. T. E., et al. An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System. J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、ヒトの神経前駆細胞(NPC)をニューロンに分化する方法を示しています。NPCは、確立されたマウスアストロサイト-ラット皮質ニューロン共培養に導入され、NPCのニューロンへの分化を促進します。分化は、共焦点顕微鏡で細胞を視覚化することによって確認されます。

プロトコル

>1. 人工多能性幹細胞の作製

1. DMEMでヒト線維芽細胞を培養し、6ウェルプレートで10%ウシ胎児血清(FBS)を添加します。
2. 線維芽細胞のリプログラミングを開始する前に、6ウェルをマトリゲルでコーティングし、室温で少なくとも1時間インキュベートします。80%のコンフルエンスで、線維芽細胞培養物から培地を取り出し、1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄します。
3. プレート全体を覆うのに十分な0.25%トリプシン-EDTAを添加し、37°Cで10分間インキュベートします。
4. 細胞がウェルから外れたら、トリプシンの2倍の量のDMEMをトリプシンの2倍の量で10%FBS添加して、トリプシン消化をクエンチします。細胞懸濁液をゆっくりと上下にピペットで動かし、細胞を分断します。血球計算盤で単一細胞の数を数えます。
5. 7 x 10⁵細胞を15 mLの遠心チューブに移し、細胞懸濁液を200 x gで5分間遠心分離します。
6. 上清を除去し、細胞ペレットをエレクトロポレーション溶液に再懸濁します。製造元の指示に従って線維芽細胞をエレクトロポレーションします。細胞を100 μlのエレクトロポレーションバッファーに再懸濁し、各エピソームベクター1 μgを加えます。1,650 V、10 ms、3 時間パルスの設定でセルをエレクトロポレートします。
7. 細胞懸濁液を、10% FBSを添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)に移し、6ウェルプレートのウェルあたり5 x 10⁴個の細胞をプレート化します。プレートを37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。
8. 48時間後、トランスフェクションした線維芽細胞培養物から培地を取り出し、mTeSR培地と交換します。人工多能性幹細胞(iPSC)コロニーを単離する準備ができるまで、毎日培地を交換してください。iPSCコロニーは28-35日後に観察できます。
9. 単離の準備ができたら、iPS細胞コロニーを機械的に切断し、10 μM Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤(Y-27632)を添加したmTeSR培地でマトリゲルコーティングされた6ウェルプレートに再播種します。培地を毎日交換してください。

2. ヒトNPCの神経誘導と維持

1. iPS細胞培養物が約20%のコンフルエントになったら、mTeSR培地を取り出し、神経誘導培地に交換します。2日おきにミディアムを補充します。
2. 7日後、神経誘導媒体を取り出し、人間のNPC維持媒体と交換します。継代培養の7日前まで、隔日で培地を補充します。
3. 継代培養の前に、プレート/フラスコを室温で少なくとも1時間マトリゲルでコーティングします。
4. コンフルエントなヒトNPC培養物から培地を取り出し、1x PBSで一度洗浄した後、PBSを吸引してオフにします。
5. すべてのウェルを覆うのに十分な細胞剥離溶液を加え、37°Cで5分間インキュベー
トします。
6. すべてのセルが分離していることを確認します。DMEM/F-12(ダルベッコのModified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)を細胞剥離液の2倍の量をウェル/フラスコに加えます。
7. DMEM/F-12を含む細胞を15 mLの遠心チューブに移し、200 x gで5分間遠心分離します。
8. 上清を除去し、細胞を5 mLのヒトNPC維持培地に再懸濁します。細胞懸濁液をゆっくりと上下にピペットで動かし、細胞を分断します。
9. 全細胞の3分の1をマトリゲルコーティングされた培養ウェル/フラスコに播種し、10 μM Y-27632を添加した十分な培地を補充します。培養容器を37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。
   1. 3〜4日ごとに1:3で文化を分割し、1日おきに培地を補充します。ヒトのNPC培養物を高密度に維持し、分化を防ぎます。

3. 共培養におけるヒトNPCのニューロンへの分化

1. レンチウイルスベクターSynapsin1-tdTomatoをヒトNPC培養液に加えてから、ニューロンへの分化を開始してください。ヒトNPCを区別する前に、アストロサイト/皮質ニューロンの共培養を前日に準備します。
2. ヒトNPC培養物を1x PBSで一度洗浄し、すべてのウェル/フラスコを覆うのに十分な細胞剥離溶液を加えてから、37°Cで5分間インキュベー
トします。
3. すべてのセルが分離していることを確認します。DMEM/F-12を細胞剥離液の2倍の量をウェル/フラスコに加えます。15 mLの遠心分離チューブに移します。200 x gで5分間遠心分離します。
4. 上清を除去し、細胞を5 mLのニューロン分化培地に再懸濁します。細胞懸濁液を上下に静かにピペットで動かし、細胞ペレットを単一細胞に分解します。血球計算盤で単一細胞の数を数えます。
5. アストロサイト/皮質ニューロン培養物から培地を慎重に吸引します。24ウェルごとに10 μM Y-27632を添加した500 μlの神経分化培地中で、ヒトNPCを5 x 10³細胞/cm²でプレート化します。ヒトのNPCを含む培地を各ウェルにそっと加えて、アストロサイトや皮質ニューロンを乱さないようにします。
6. プレートを37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。少なくとも28日間、2〜3日ごとに培地の半分を新鮮な培地と交換します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Epi5 エピソーム iPSC リプログラミングキット	インビトゲン	A15960 の
DMEM/F12	ロンザ	12719階
マトリゲル	BDバイオサイエンス	354277
神経基礎媒体	インビトゲン	21103049
BSAの	シグマ	A7906
PBSの	サーモサイエンティフィック	02 SH30028月
15ml遠心分離管	BDバイオサイエンス	352096
トリプシン-EDTA	インビトゲン	25200056
50ml遠心分離管	BDバイオサイエンス	352070
24ウェルプレート	コーニング	9761146
6ウェルプレート	コーニング	720083
T25フラスコ	コーニング	430641
ネオントランスフェクションシステム	インビトゲン	MPK5000	ヒト線維芽細胞のエレクトロポレーションに
正常な皮膚ヒト線維芽細胞	プロモセル	C12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE	アドジーン	20945

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