方法論記事

線虫の産卵行動を制御する個々のニューロンにおけるカルシウムイメージング

2025年7月8日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Ravi, B. et al., Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、遺伝的にコードされた蛍光レポータータンパク質を使用して、行動する線虫の個々のニューロンにおけるカルシウムイメージングの技術を示しています。これは、ワームの動きをイメージングし、ニューロンからのレポーター蛍光比を測定して、細胞内のカルシウムレベルをニューロンの活動および産卵中の行動変化と相関させる手順を概説しています。

プロトコル

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1. 動物の系統、培養培地、および取り付け

  1. OP50 E. coli細菌性食品を播種した標準的な60 mm線虫増殖培地(NGM)寒天プレートで、C. elegansワームを20°Cで増殖させます。
  2. 目的の細胞特異的プロモーターごとに 2 つのプラスミドを調製します: 1 つは、GCaMP5 の駆動発現による細胞内 Ca2+ の記録、もう 1 つは mCherry の駆動発現により、GCaMP5 蛍光変化のレシオメトリック定量を可能にし、物体の検索と測定を簡素化します。
    手記：GCaMP5:mCherryレシオメトリックイメージングは、細胞内Ca2+の実際の変化ではなく、焦点や動物の動きの変化に起因するGCaMP5蛍光の変動を補正します。
  3. LX1832 lite-1(ce314)、lin-15(n765ts) X変異動物の生殖腺に、GCaMP5およびmCherryを発現するプラスミドをpL15EK可視レスキューマーカープラスミドとともに注入し、GCaMP5およびmCherryを発現する非Muv lin-15(+)動物を高コピー導入遺伝子から回収します。lite-1 ミュータントの背景を使用して、ブルーライト回避動作を減らします。
  4. 染色体への導入遺伝子を統合してモザイク現象を減らし、複合変異株の生成を簡素化する
    手記：ここで説明するLX2004株は、nlp-3プロモーターのHSNにGCaMP5およびmCherryを発現する統合された高コピー導入遺伝子を持っています(材料の表を参照)。nlp-3プロモーターは、試験した他のプロモーター(tph-1、egl-6、unc-86など)と比較して、HSNの発生や産卵行動に重大な欠陥を引き起こすことなく、後期L4および成体動物のHSNで強い発現を促進することがわかりました。この系統およびGCaMP5およびmCherryを腹側(VC)運動ニューロン、外陰筋、およびuv1神経内分泌細胞に発現する他の系統は、Caenorhabditis Genetics Centerから入手可能であり、その構造の詳細が説明されています。
  5. 播種したNGM寒天プレートからOP50細菌性食品をプラチナワームピックの底に塗布し、それを使用して、nlp-3プロモーターからHSNにGCaMP5とmCherryを発現する20匹の後期L4 LX2004動物を~20匹移します。発達中の外陰部が、白い三日月に囲まれた明確な暗いスポットとして実体顕微鏡に表示されることを確認します。動物を20°Cで24〜40時間インキュベートします。
  6. インキュベーション後、OP50をピックに塗布し、~3匹の寄生虫を播種していないNGMプレートに移し、イメージング中に寄生虫が餌となる餌を少量残します。バクテリアフードが少なすぎるとワームがプレートの中心から離れてさまよい、フードが多すぎるとバックグラウンド蛍光が増加して低酸素症を引き起こすため、十分なフードを確保します。
  7. 平らな丸いヘラを使用して、ワームを運ぶプレートから ~ 20 mm x 20 mm のチャンクを切り取り、そのチャンクを下にしてきれいな 24 mm x 60 mm #1.5 カバースリップの中心に移します (図 1)。アプリケーションを片側から起動して、気泡がカバーガラスの下に閉じ込められてイメージングに干渉しないようにします。チャンクの上部に22 mm x 22 mm #1カバースリップを貼り付けて、固着と蒸発を減らします。

2. ハードウェアと計装のセットアップ

  1. ≥ 0.7 Numerical Aperture Plan-Apochromat 20x 対物レンズ、ジョイスティック、イメージスプリッター、GCaMP5 と mCherry の同時励起および発光用の蛍光フィルター、蛍光および赤外線明視野イメージング用のカメラ、トリガー可能な発光ダイオード (LED) 照明システム (図 2A)を備えた倒立顕微鏡のステージに、ステージ化されたトランスジェニック線虫を配置します (図 2A).
    注:80/20ビームスプリッターは、画像信号の80%を蛍光カメラに、20%を明視野カメラに送信します。正立顕微鏡も使用できますが、この場合、NGMチャンクはスライドガラスと大きなカバースリップの間に配置する必要があります。
    1. 双眼接眼レンズを使用して、イメージング用のワームを選択します。動物を選択したら、赤外線フィルターをコンデンサーの上の所定の位置にスライドさせます。
  2. トランジスタ・トランジスタ・ロジック(TTL)トリガ
    1. 蛍光カメラの3つのTTLトリガー出力ラインのそれぞれから同軸ケーブルを取り付けます。最初の出力をLED照明システムのBNC入力#3に接続します。
    2. 2番目の出力を、赤外線カメラのGPIO入力#3(ピン4)とアース(ピン5)にそれぞれつながる8ピンGPIOコネクタからの緑と茶色のワイヤを使用してBNC「バナナ」アダプターに接続します。
    3. 3番目の出力をBNC「バナナ」アダプタに接続し、ジャンパ線をデジタル集録デバイスの#8デジタル入力とグランドに接続します(図2B)。
  3. デジタル集録デバイス(DAQ)
    1. DAQマイクロコントローラボード(資料の表を参照)をUSBケーブルでPCに接続します。標準の Firmata プロトコル (資料の表を参照) でファームウェアを更新し、USB ポートを 57600 ボーで通信するように設定します。
  4. LEDの
    1. LEDコントローラーソフトウェアを実行します(資料の表を参照)。トリガーモードを「連続」から「ゲート」に切り替え、470nmと590nmの両方のLEDに対してトリガーチャネル「3」を選択します。
    2. 電源を入れて、各LEDのLED電源を入力します(たとえば、470 nm LEDを20%に、590 nm LEDを40%に設定します)。
  5. Bonsai でシリアル ステージ通信スクリプト 'XY-stage-final' を実行します (資料の表を参照)。灰色の「CsvWriter」ノードをクリックし、記録されたXおよびYステージ情報を保存するフォルダを選択します(図3)。ツールバーの緑色の矢印を押して、DAQ.
    を初期化します 手記：蛍光カメラがTTL信号を送信すると、スクリプトはXステージとYステージ位置の記録を開始します。このスクリプトは、フレーム番号、X 位置 (μm)、Y 位置 (μm)、フレーム間間隔 (s) の 4 列のデータを出力します。
  6. 赤外線カメラ録画ソフト(資料表参照)の「カスタムビデオモード」で「モード1」(2×2ビニング、1,024×1,024ピクセル)と「ピクセルフォーマットRAW8」を選択します。「トリガー/ストロボ」で、トリガー入力ライン(GPIO)を「3」に、極性を「高」に、「モード」を「14」に設定します。「有効」を切り替えて、TTLトリガー信号を受信するまでフレーム取得を停止します。
    1. そのウィンドウを開いたまま、メインカメラビューツールバーの赤い[録画]ボタンをクリックします。画像シーケンスを保存するフォルダを選択します。「バッファリング」記録モードを選択し、「画像」をJPEG形式で保存します。「Start Recording」をクリックして、集録を初期化します。
  7. 蛍光カメラとイメージスプリッター
    手記：レシオメトリック定量のための適切な画像レジストレーションを確保するために、GCaMP5とmCherryの蛍光チャンネルを同時に収集する必要があります。イメージスプリッターにより、GCaMP5とmCherryの蛍光を1つのセンサーに2チャンネルで取得できます。
    1. 画像取得ソフトウェアの[キャプチャ]タブ(材料の表を参照)で、露光時間を10ミリ秒に、ビニングを4倍に、画像深度を16ビットに設定します。幅 512 ピクセル、高さ 256 ピクセルの中央にカメラ サブアレイを選択します。「Show Output Trigger Options」をクリックし、すべてのトリガーを「Positive」に設定します。'
      メモ: DAQは、TTLトリガが10ミリ秒以下の場合、TTLトリガを見逃すことがあります。
    2. 「トリガー 1」と「トリガー 2」が「露出」に設定され、「トリガー 3」が「プログラム可能」に設定され、「期間」が 25 ミリ秒に設定されていることを確認します。[Sequence] タブで [Time Lapse] を選択し、[Field Delay1] を 50 ms にして 20 Hz で画像を収集し、[Save to Temporary Buffer] を選択します。
  8. 3チャンネル共焦点イメージング中のPMTゲインとレーザー強度
    1. PMTゲインを設定して、バックグラウンド蛍光が最小値(黒レベル)のすぐ上のレベルになるようにします。561 nm(緑)のレーザー出力を、mCherryチャネルのシナプス前末端に1つの飽和した12ビットまたは16ビットピクセルが観察されるまで
      2. 増加させます。
    2. GCaMP5の蛍光が背景の上のシナプス前末端にちょうど見えるように、488 nm(青色)のレーザー強度を調整します。この低い設定により、強いCa2+過渡現象に応答して蛍光が増加するときに、GCaMP5ピクセルの飽和が防止されます。共焦点ピンホールを完全に開いて、光の取り込みを最大化します。

3. レシオメトリック CA2+ イメージングと動作記録

  1. 蛍光取得ソフトウェアの「Sequence」タブで、「Start」をクリックして記録を開始します。ジョイスティックで線虫を追跡し、目的の細胞とシナプスに焦点を合わせ、視野(FOV)の中心に保ちます。ヒストグラムウィンドウの[統計]ボタンをクリックすると、各チャネルのピクセル統計が表示されます。
  2. LEDの電力を調整して、シナプス前末端で最大のシングルピクセルmCherry蛍光を確保し、≥8,000カウント(~4,000光電子)で、バックグラウンド上に~12ビットのダイナミックレンジ(~100光電子)を提供します。安静時(低)Ca2+中のシナプス前末端でのGCaMP5シグナルは、背景の上に見える程度で、約~2,500カウントであるはずです。
  3. 1つの産卵活動状態に達するまで記録します;通常、これは野生型のワームで20〜30分ごとに発生します。最初の産卵イベント(フレーム6,001)の前後6,000フレームの10分間のサブセット(12,001フレーム)を保存します。線虫の挙動とXYステージ位置の時点の明視野画像の同じサブセットを保持しておくと、データストリームの正確な同期が失われます。
  4. ImageJ と BioFormats プラグイン(材料表を参照)を使用して、画像配列を Image Cytometry Standard (.ics) 形式に変換し、Ratiometric Quantitation ソフトウェアにインポートできるようにします。

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結果

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figure-results-1
図1. 産卵回路の活動と挙動を高解像度でイメージングするためのC.エレガンスマウント技術。上、側面から見た最後のマウント。下部は、大きなカバースリップの下部から見た最終的なマウントです。矢印はOP50細菌性食品、C.エレガンス線虫、卵をNGM寒天チャンクと24mm×60mmの大型カバースリップで挟んだものです。

figure-results-2
図 2.倒立落射蛍光顕微鏡での広視野レシオメトリックCa2+イメージングおよび挙動記録。(

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C.エレガンスの成長、栽培、および取り付け
大腸菌菌株、OP50カエノーラブディティス遺伝センターOP50C.エレガンスの餌。ウラシル補助栄養剤。大腸菌 B.バイオセーフティレベル1
HSN GCaMP5+mチェリーウォームカエノーラブディティス遺伝センターLX2004nlp-3プロモーターを用いた統合導入遺伝子によるHSNにおけるGCaMP5およびmCherry発現の促進完全な遺伝子型:
vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
LITE-1(CE314)、LIN-15(N765TS)導入遺伝子調製用変異株著者LX1832pL15EK lin-15(n765ts)レスキュープラスミドによるマイクロインジェクション後の高コピー導入遺伝子の回収株。また、青色光の感受性を低下させるlinked lite-1(ce314)変異も持っています。リクエストに応じて著者から入手可能
pL15EK lin-15a/b ゲノムレスキュープラスミド著者pL15EKトランスジェニック動物をLX1832
に注入した後の回収のためのレスキュープラスミド lite-1(ce314)、lin-15(n765ts)X株。リクエストに応じて著者から入手可能
pKMC299プラスミド著者pKMC299nlp-3プロモーター由来のHSNにおけるmCherry発現のためのプラスミド。nlp-3 3' 非翻訳領域を持つ
pKMC300プラスミド著者pKMC300nlp-3プロモーター由来のHSNにおけるGCaMP5の発現のためのプラスミド。nlp-3 3' 非翻訳領域を持つ
リン酸カリウム一塩基性シグマP8281NGMプレートの調製に
リン酸カリウム二塩基性シグマP5655型NGMプレートの調製に
硫酸マグネシウム七水和物アムレスコ662NGMプレートの調製に
塩化カルシウム二水和物アルファ・アエサル12312NGMプレートの調製に
ペプトンベクトン・ディキンソン211820NGMプレートの調製に
塩化ナトリウムアムレスコ241NGMプレートの調製に
コレステロールアルファ・アエサルA11470 (英語)NGMプレートの調製に
寒天、細菌学A型、超高純度アフィメトリックス10906NGMプレートの調製に
60mmシャーレVWRの25384から164 NGMプレートの調製に
24 x 60 mm マイクロカバーグラス、#1.5VWRの48393-251ワームをイメージするためのカバーガラス
22 x 22 mm マイクロカバー グラス、#1VWRの48366-067寒天チャンクの上部を覆うカバーガラス
透過光ベース付き実体顕微鏡ライカM50ウォーム株のメンテナンス、ステージング、および取り付けのための解剖顕微鏡
プラチナイリジウムワイヤー、(80:20)、0.2mmアルファ・アザールAA39526-BWウォームトランスファー用
カルシウムイメージング顕微鏡
防振エアテーブルTMCの63から544Micro-g' ラボテーブル 30インチ x 48インチ 防振テーブル、25mm トップに 4 インチ CleanTop M6
倒立型複合顕微鏡ツァイス431007-9902-000Axio Observer.Z1倒立顕微鏡
サイドポート L80/R100 (3ポジション)ツァイス425165-0000-000出力の20%を明視野(CMOS)カメラに、80%を蛍光(sCMOS)カメラに振り分ける
チルトバックイルミネーションキャリアツァイス423920-0000-000赤外線/行動イメージング用
ランプハウジング 12V/100W (コレクタ付きツァイス423000-9901-000赤外線/行動イメージング用
ハロゲンランプ 12V/100Wツァイス380059-1660-000赤外線/行動イメージング用。白色光LEDは大きな赤外光を放出しないため、赤外線バンドパスフィルター後の明視野イメージングは許可されません
ハロゲンランプ用32 mm赤外線バンドパスフィルター(750-790 nm)ツァイス447958-9000-000BPの750-790;DMR 32mm、明視野および挙動のための赤外線照明用
6フィルターコンデンサータレット(LD 0.55 H/DIC/Ph)、電動式ツァイス424244-0000-000赤外線/行動イメージング用
コンデンサー&シャッターツァイス423921-0000-000赤外線/行動イメージング用
赤外線CMOSカメラ用フォトチューブ付き双眼接眼レンズツァイス425536-0000-000赤外線/行動イメージング用
接眼レンズ 10倍、23mmツァイス444036-9000-000寒天チャンク上のワームの局在
Cマウントアダプター 2/3インチ 0.63倍拡大鏡ツァイス426113-0000-000赤外線CMOSカメラ用マウント
赤外線明視野および動作用CMOSカメラ(1インチセンサー)FLIR(旧ポイントグレイリサーチ)GS3-U3-41C6NIR-C明視野イメージング用カメラ
USB 3.0ホストコントローラカードFLIR(旧ポイントグレイリサーチ)ACC-01-1202Fresco FL1100、4ポート
8ピン、1m GPIOケーブル、ヒロセ電機HR25丸型コネクタ FLIR(旧ポイントグレイリサーチ)ACC-01-3000TTLトリガー用ケーブル。緑色のワイヤはGPIO3 /ピン4に接続し、茶色のワイヤはグランド/ピン5に接続します
プランアポクロマート 20x/0.8 WD=0.55 M27ツァイス420650-9901-000倍率、絞り数、作動距離の最適な組み合わせ
6キューブリフレクタータレット、電動ツァイス424947-0000-000蛍光イメージング用
蛍光灯列、電動ツァイス423607-0000-000蛍光イメージング用
蛍光シャッターツァイス423625-0000-000蛍光イメージング用
GFPとmCherryのデュアル励起および発光フィルターキューブ(顕微鏡用)ツァイス489062-9901-000蛍光イメージング用FLフィルターセット62 HE BFP+GFP+HcRed
LED照明システムツァイス423052-9501-000蛍光灯用トリガー式Colibri.2 LEDシステム
GFP LEDモジュール(470 nm)ツァイス423052-9052-000Colibri.2 GFP蛍光励起用LED
mCherry LEDモジュール(590nm)ツァイス423052-9082-000Colibri.2 mCherry蛍光励起用LED
入射光器用アイリスストップスライダーツァイス000000-1062-360カメラの視野にLED照明を制限するためのフィールドアパーチャアイリス
Cマウントアダプター 1インチ 1.0xツァイス426114-0000-000イメージスプリッター、sCMOS蛍光カメラ用アダプター
画像スプリッター浜松A12801-01Gemini W-View、他の画像スプリッターを使用することもできますが、sCMOSカメラの大きなセンサーサイズには最適化されていない可能性があります
GFP/mCherryダイクロイックミラー(イメージスプリッター)セムロックDI02-R594-25x36GCaMP5をmCherry信号と赤外線信号から分離
GFP発光フィルター(画像スプリッター)セムロックFF01-525/30-25GCaMP5蛍光の捕捉
mCherry/発光フィルター(画像スプリッター)セムロックFF01-647/57-25このフィルターは、明視野イメージングに使用される赤外線を除外するために必要です
蛍光用sCMOSカメラ(1インチセンサー)浜松A12802-01 / C11440-22CUオルカフラッシュ4.0 V2。新しいモデルでは、センサーの別々の半分に別々の画像取得設定が可能になり、画像スプリッターと組み合わせて2チャンネルの画像を取得できる
電動XYステージメルツホイザースキャンIM 130 x 100ステージ移動、このステージのXY分解能はステップあたり0.2μmです
ジョイスティック付きXYステージコントローラーLUDL (英語MAC6000、XYジョイスティックワームの手動追跡。MAC6000コントローラーは、115200ボーに設定されたシリアル(RS-232)ポートを介してPCに接続する必要があります
デジタルアクイジションボード(DAQ)Arduinoの宇野sCMOSカメラからのTTLトリガーの受信。Unoには標準のFirmataパッケージをロードし、コンピューターのUSBポートを57600ボーに設定する必要があります
BNC オス - BNC オス ケーブル - 6 フィートホサテクノロジーホッブ6TTLトリガ用のBNCコネクタ
金メッキBNCオス-SMAオス同軸ケーブル(8.8インチ)UXCELLの6.08642E+11蛍光カメラのトリガー出力を接続するには
BNCターンヘッドアダプターハンテックRRBNCTH21BNC-バナナプラグアダプター(4mm)
BNCメス-メスコネクタディアゲン20130530009カメラからのBNC出力をバナナプラグに接続するためのメス-メスBNCアダプター
はんだ不要のフレキシブルブレッドボードジャンパーワイヤーZ&T(ジーアンドティー)GK1212827BNCトリガ出力をArduiono DAQに接続します。
高性能ワークステーションホームページZ820Windows 7、64GB RAM、デュアルXeonプロセッサ、ソリッドステートC:ドライブ、シリアル(RS-232)ポート、イーサネット接続用の複数のPCIe3スロット、USB 3.0カード、および追加のソリッドステートドライブ
M.2ソリッドステートドライブサムスンMZ-V5P512BW画像データの高速ストリーミングと解析
M.2ワークステーション用ソリッドステートドライブアダプターライコムDT-120M.2 to PCIe 3.0 4レーン・アダプター
ネットワーク接続ストレージシロヤDS-2415+のイメージングデータの保存と分析
ハードディスクドライブウエスタンデジタルWD80EFZXRED 8 TB、5400 RPM クラス SATA 6 Gb/s 128MB キャッシュ 3.5 インチイメージングデータの保存(10ドライブ+2ドライブ冗長性)
ソフトウェア
蛍光取得浜松HCImage DIAの2チャンネル(GCaMP5およびmCherry)蛍光画像シーケンスを20fpsで記録
明視野の買収FLIR(旧ポイントグレイリサーチ)フライキャプチャー明視野JPEG画像シーケンスの記録
ステージシリアルポートリーダー盆栽https://bitbucket.org/horizongir/bonsai行動中のワームの追跡を容易にします
LEDコントローラーソフトウェアツァイスマイクロツールボックステスト2011Colibri.2ユニットのさまざまなLEDの強度とトリガー入力を設定するには
イメージJ NIHのhttps://imagej.net/Fiji/Downloads画像配列とフォーマット変更を簡単に確認し、Ratiometric Quantitationソフトウェアにインポート
秀でるマイクロソフト 2002984-001-000001MATLAB 解析のために Volocity からカンマ区切り値データのサブセットを生成するため
ピーク検出MATLABR2017aのレシオピーク機能の計算に使用されるスクリプト
レシオメトリック定量パーキン・エルマーボロシティ 6.3レシオメトリック画像チャンネルの計算、オブジェクト検出のための画像セグメンテーション、および検出済みオブジェクトの比率測定を容易にします
スクリプト
AnalyzeGCaMP_2017.mMATLAB平均比と XY 重心スクリプトレシオメトリック出力を.csv形式で解析し、オブジェクトと重心位置を統合し、比率の変化(ΔR/R)を計算し、ピークとピーク特徴を特定し、プロット(注釈付きピークあり/なし)をPostScript形式で書き込みます。マトリックスファイルのインポートの場合、スクリプトはデータを分析済み、ピーク、トレースの3つのフォルダーに出力します。「Analyzed」出力は、時間(s)、面積(square microns)、比率、X重心(ミクロン)、Y重心(ミクロン)、およびΔR/Rの6つの列(単位)を持つ統合オブジェクトのマトリックスファイルです。「Peaks」出力は、検出されたピークの時点、振幅(ΔR/R)、ピーク幅(s)、 そしてピークの隆起。'Traces' 出力はカルシウムトレースの PostScript ファイルです。
XY-stage-final.盆栽盆栽TTLトリガDAQおよびステージ位置シリアルポートリーダーフレーム露光中に接続されたArduinoがsCMOSカメラから正のTTL信号を受信したときのXステージ位置とYステージ位置(ミクロン単位)を記録します。スクリプトは、フレーム番号、X 位置 (ミクロン)、Y 位置 (ミクロン)、フレーム間の経過時間 (20 fps で記録する場合は通常 ~50 ミリ秒) の 4 つの列を持つ .csv T ファイルを書き込みます。この出力の X ステージ位置と Y ステージ位置 (それぞれ列 2 と 3) は、AnalyzeGCaM の X と Y の重心位置に追加されます
の 型 名 名 の の ) 化 する ようになった ) の の

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GCaMP5 mCherry

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