脳スライスにおける小児性核ニューロンからのガンマバンド振動の記録

要約

出典:Urbano, F. J., et al. Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons. J. Vis. Exp. (2016年)。

このビデオは、PPNニューロンのガンマバンド振動を記録する方法を示しています。aCSFのシナプス遮断薬を含むサジタル脳切片を使用して、パッチピペットを介した正電流パルスを使用してカルシウムチャネルを開き、覚醒のための重要な閾値以下の活動を誘導します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 標準人工脳脊髄液(aCSF)の調製

1. 原液Aの調製
   1. 化学薬品を追加する前に、きれいな1Lビーカーに700mlの蒸留水を加えます。
   2. 500mlの容量で連続的に撹拌しながら、136.75gのNaCl、6.99gのKCl、2.89gの_MgSO4、および2.83gのNaH2PO4を添加します。
   3. 蒸留水を追加して、最終容量を1 Lにします。希釈後、各化合物の最終濃度は117 mM NaCl、4.69 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、および1.18 mM NaH₂PO₄です。
   4. 4°Cで最大2週間冷蔵保管します。
2. ストック溶液Bの調製
   1. 化学薬品を追加する前に、きれいな700Lビーカーに蒸留水1mlを追加します。
   2. 500mlの容量で連続的に撹拌しながら、41.45gのD-グルコースと41.84gのNaHCO₃を添加する。
   3. 蒸留水を追加して、最終容量を1 Lにします。希釈後、各化合物の最終濃度は11.5 mM D-グルコースおよび24.9 mM NaHCO₃です。
   4. 4°Cで最大2週間冷蔵保管します。
   5. 各実験の前に、50 mlのストックAと50 mlのストックBを混合し、蒸留水で1 Lに持ってきて最終濃度のaCSF溶液を取得し、カルボゲン(95%O₂ - 5%CO₂ mix)で少なくとも30分間連続的に酸素化しながらRTに放置します。

2. スクロース人工脳脊髄液(Sucrose-aCSF)の調製

1. ストック溶液Cの調製
   1. 化学薬品を追加する前に、きれいな1Lビーカーに700mlの蒸留水を加えます。
   2. 500mlの蒸留水を連続的に撹拌しながら、240gのスクロース、6.55gのNaHCO₃、0.671gのKCl、4.88gのMgCl₂、0.22gのCaCl_2、および0.21gのアスコルビン酸を添加する。
   3. 蒸留水を追加して、最終容量を1 Lにします。希釈後、各化合物の最終濃度は701.1 mMスクロース、78 mM NaHCO₃、9 mM KCl、24 mM MgCl₂、1.5 mM CaCl_2、および1.2 mMアスコルビン酸です。
   4. 原液Cを4°Cで最大1週間保管します。
   5. 各実験の前に、300 mLの50 mlのストックCを600 mLの蒸留水と混合して、最終濃度のスクロース-aCSF溶液を得ます。カルボゲン(95%O₂ - 5%CO₂ミックス)で少なくとも30分間連続的に酸素化しながら、室温で放置します。

3. スライスの準備

1. 100 mLのスクロース-aCSF溶液を入れたきれいなビーカーを氷に入れ、カルボゲンで酸素化し、0.1 M NaOH溶液(pH < 7.4の場合)または0.1 M HCl溶液(pH > 7.4の場合)を数滴加えながら、pHメーターを使用してpHを7.4に固定します。
2. ビブラトームの切断チャンバーにスクロース-aCSFを充填し、酸素化します。カッティングチャンバーに結合されたグリセロールベースの冷凍システムをオンにし、15分間待って0〜4°Cまで冷却します。
3. ラットの子犬(成体の時限妊娠したSprague-Dawleyラットの9〜12歳)にケタミン(70 mg / kg、i.p.;最終容量<50μlを使用)で麻酔します。.子犬が落ち着いているときは、尻尾の挟み込みがないことを再確認してください。
4. 子犬の首を切る。
   1. 炭素鋼のメスの刃を使用して頭の皮膚を前から後ろに縦に切り、鉗子を使用して皮膚を横に引っ張ります。脳を覆っている骨を切断し、ハサミを横に動かし、完全に取り除いて脳を露出させます。
   2. 次に、へらを使用して脳をすばやく取り出します(最初は嗅球の下に置かれ、最も吻側から最も尾側の領域に向かって脳をそっと押し出します)。氷冷した酸素化スクロース人工脳脊髄液(スクロース-aCSF)に脳をそっと押し込みます。
5. 右半球に傍矢状切開を行い(半球の約3分の1を除去)、脳のトリミングされた面をバイブロスライサーの切断チャンバーに磁気的に固定される金属ディスクに接着して、脚状核(PPN)を含む矢状400μm切片を切断します。PPNスライスをRTで45分間保持してから、全細胞パッチクランプ記録を行います。

4. PPNスライスにおけるガンマバンド振動の記録

1. グルコン酸カリウム細胞内溶液(High-K+溶液)の調製
   1. 10mlの蒸留水を入れたきれいなビーカーを氷の中に置きます。連続的に攪拌しながら、K+-グルコン酸、90.68 mgのホスホクレアチンジトリス塩、47.66 mg HEPES、1.5 mg EGTA、40.58 mg^{Mg 2 +}-ATP、および4 mg Na ⁺ _2-GTPを添加します。
   2. KOH(蒸留水で100 mM)を使用してpHを7.3に調整します。蒸留水を加えて、最終容量が20mLになるようにします。必要に応じて、スクロース(蒸留水中で100 mM)による浸透圧を280〜290 mOsmに調整します。希釈後、各化合物の最終濃度は124 mM K+-グルコン酸、10 mMクレアチンリン酸ジトリス塩、10 mM HEPES、0.2 mM EGTA、4 mM Mg²⁺-ATP、および0.3 mM Na⁺_2-GTPです。
   3. 細胞内溶液を1 mLのチューブに分注し、-20°Cで凍結します。1日1回の分注を使用し、実験中は4°Cに保ちます。
2. 全細胞パッチクランプ録音
   1. スライスを浸漬チャンバーに入れ、次の受容体拮抗薬を含む酸素化(95%O_2-5%CO₂)aCSFでそれら(1.5 ml / min)を灌流します：選択的NMDA受容体拮抗薬2-アミノ-5-ホスホ吉草酸(APV、40μM)、競合AMPA /カイニン酸グルタミン酸受容体拮抗薬6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン(CNQX、10μM)、グリシン受容体拮抗薬ストリキニーネ(STR、 10μM)、特異的_{GABA受容体}拮抗薬ガバジン(GBZ、10μM)、およびナトリウムチャネル遮断薬テトロドトキシン(TTX、3μM)
      記録用パッチピペット(抵抗値2-7MΩ、外径1.0mm、内径0.6mmの市販の厚肉ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用)に、市販の溶液フィルター付きパッチピペットフィラーを使用して、細胞内high-K+溶液を充填します。ピペットをアンプのホルダーに挿入します。ピペットホルダーに接続された1mlシリンジを使用して、三方弁に接続されたシリコンチューブを使用して小さな陽圧を加えます。ピペットホルダーの背面をパッチクランプに接続しますamp amplifier。
   4
   2. 倍対物レンズと近赤外微分干渉コントラスト光学系を組み合わせた4倍対物レンズを使用して、PPN核の近くで機械式マイクロマニピュレーターを使用して記録ピペットを動かします><。 手記： PPN核は、上小脳脚(SCP;軸索の厚い束として観察可能)の背側のスライスで観察できます。記録ピペットは、花柄の後端のすぐ背側に位置するPPNパースコンパクタに配置されていました。
   3. 40倍水浸レンズを使用して視覚化しながら、記録ピペットをPPNニューロンに接触させ、負の吸引を迅速に適用して細胞とのシールを形成します。
   4. 電圧クランプシールソフトウェアを使用して、メーカーのプロトコルを使用して負の吸引中のピペット抵抗を監視します。
      1. 負の吸引がゆっくりと増加し、ピペットの先端にあるパッチクランプモニターによって読み取られた抵抗値が80〜100MΩに達すると、保持電位を-50mVに急速に変化させ、負圧を解放します。ニューロンの膜が破裂し、細胞全体の構成で電気的アクセスが達成されるまで、負の吸引を継続的に適用し始めます。
      2. ボルテージクランプシールソフトウェアで測定したアクセス抵抗値が10MΩ以上の場合は、負の吸引を少量ずつ続けてください。
   5. 静電容量(つまり、セルの膜を破裂させた後に観察される低速および高速の過渡現象)と電圧クランプモードでの直列抵抗を補償します。録音モードを電流クランプに切り替え、ブリッジ値を迅速に補正します(たとえば、アンプノブを動かすか、コンピューターのマウスを使用して自動補正メニューをクリックします)。
      1. メーカーのプロトコルを使用して記録されているPPNニューロンの静止膜電位を継続的に監視します。静止膜電位が脱分極または過分極値にシフトする場合は、少量の直流(最大100 pA)を使用して、最適な-50 mVの最終値を維持します。
         手記： -48 mV以上の安定した静止膜電位(RMP)を持つPPNニューロンのみを保持します(つまり、RMP<-48 mV)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S8501	C12H22O11、分子量= 342.30
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S6014	NaHCO3、分子量= 84.01
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P3911	KCl、分子量= 74.55
塩化マグネシウム六水和物	シグマ・アルドリッチ	M9272	MgCl2・6H2O、分子量=203.30
塩化カルシウム二水和物	シグマ・アルドリッチ	C3881	CaCl2・2H2O、分子量=147.02
D-(+)-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G5767	C6H12O6、分子量= 180.16
L-アスコルビン酸	シグマ・アルドリッチ	A5960	C6H8O6、分子量= 176.12
塩化ナトリウム	アクロスオーガニックス	327300025	NaCl、分子量= 58.44
グルコン酸カリウム	シグマ・アルドリッチ	G4500	C6H11KO7、分子量= 234.25
ホスホクレアチンジ(トリス)塩	シグマ・アルドリッチ	P1937	C4H10N3O5P・2C4H11NO3、分子量=453.38
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J	C8H18N2O4S、分子量= 238.30
エグタ	シグマ・アルドリッチ	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2、分子量=380.40
アデノシン5'-三リン酸マグネシウム塩	シグマ・アルドリッチ	A9187の	C10H16N5O13P3・xMg2+、分子量=507.18
グアノシン5'-三リン酸ナトリウム塩水和物	シグマ・アルドリッチ	G8877	C10H16N5O14P3・xNa+、分子量=523.18
クエン酸テトロドトキシン	アロモンラボ	T-550	C11H17N3O8、分子量= 319.27
DL-2-アミノ-5-ホスホ吉草酸	シグマ・アルドリッチ	A5282の	C5H12NO5P、分子量= 197.13
CNQX二ナトリウム塩水和物	シグマ・アルドリッチ	C239	C9H2N4Na2O4・xH2O、分子量=276.12
ストリキニーネ	シグマ・アルドリッチ	S0532	C21H22N2O2、分子量= 334.41
メカミラミン塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	M9020	C11H21N・HCl、分子量=203.75
ガバジン(SR-95531)	シグマ・アルドリッチ	S106	C15H18BrN3O3、分子量= 368.23
ケタミン塩酸塩	マイラン	67457から001から00
顕微鏡	ニコン	エクリプスE600FN
マイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	ロー200
マイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	MPC-200
増幅器	分子デバイス	マルチクランプ700B
A/Dコンバーター	分子デバイス	デジデータ 1440A
ヒーター	ワーナー・インストゥルメンツ	TC-324Bの
ポンプ	コール・パーマー	マスターフレックスL / S 7519-20
ポンプカートリッジ	コール・パーマー	マスターフレックス7519-85
ピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-97
カメラ	Qイメージング	RET-200R-F-M-12-C
ビブラトーム	ライカバイオシステムズ	ライカ VT1200 S
冷凍システム	ビブラートーム楽器	900アール
備品
顕微鏡	ニコン	エクリプスE600FN
マイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	ロー200
マイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	MPC-200
増幅器	分子デバイス	マルチクランプ700B
A/Dコンバーター	分子デバイス	デジデータ 1440A
ヒーター	ワーナー・インストゥルメンツ	TC-324Bの
ポンプ	コール・パーマー	マスターフレックスL / S 7519-20
ポンプカートリッジ	コール・パーマー	マスターフレックス7519-85
ピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-97
カメラ	Qイメージング	RET-200R-F-M-12-C

シリーズ シリーズ の シリーズ の