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1。光トラッピングのための病原体の培養条件
- 3日間、30℃でSBD（サブローデキストロース）を含む半固体寒天培地上でA. フミを （B-5233/RGD12-8）成長する。
- C.を拡大30℃シェーカーインキュベーターで一晩100μg/ mlのアンピシリンを含有するYPDでアルビカンス （SC5314）（酵母ペプトンデキストロース）液体培養℃に
2。蛍光標識のための病原体の調製
- 収穫は、病原体の量を求め、1.5 mLの反応チューブに移す。
- リン酸塩の追加300μLを反応管に緩衝食塩水（PBS）。
- 30秒間混合物を超音波処理してください。
- 1分間4000 rpmで遠心する。
- ペレットを残す、上清を吸引除去する。
- リピート（2.4）と（2.5）をさらに2回。
- PBSの500μLに再懸濁します。
3。蛍光色素を用いて病原体のラベリング
- 100μLのジメチルホルムアミド（DMF）（10 mg / mLの濃度）に関心の色素（例えばのAlexa Fluor ® 488のAlexa Fluor 647）1mgを溶解する。
- 洗浄後の病原体を含む反応管に染料混合物を3μLを加える。
- ° Cで1時間の回転または37サンプルを振る。
- 1分間4000rpmで遠心分離することによってPBS 3Xでサンプルを洗浄してください。
- PBS 300μlで再懸濁します。
4。全血からT細胞を収穫
- 全血を（新鮮な）を取得。
- 暖かい血、PBS + 2％ウシ胎児血清（FBS）、および室温にhistopaque。
- 全血の50μL/ mLでRosetteSepヒトCD4 + T細胞の濃縮カクテルを追加。
- サンプルを回転させ、室温で20分間インキュベートする。
- PBS + 2％FBS等量のサンプルを希釈し、穏やかに混合する。
- 層は、混合を最小限に抑え、histopaqueの上にサンプルを希釈
- ブレーキオフ、室温で1,200 xgで20分間遠心。
- 豊かなセルを削除します。
- PBS + 2％FBS溶液で2倍濃縮された細胞を洗浄。
- 赤血球の溶解用緩衝液で2分間赤血球を溶解する
- PBS + 2％FBSを10 mLを加え、5分間1500rpmで溶解赤血球を遠心分離
- ペレットを乱さないように注意して、上清を吸引する
- 10％ウシ胎児血清を含むIMDM培地中に再懸濁します。
5。チャンバースライドにRAW 264.7マクロファージの調製
- DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）は10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L -グルタミンを含むように準備します。
- 37〜温かいお風呂で暖かいメディア、トリプシン、およびPBS℃に
- PBSでプレートの2倍を洗う
- それぞれの洗浄の間にPBSを吸引除去する。
- （10cmの組織培養プレート用）表面を覆うようにプレートに5 mLのトリプシンを追加。
- 37℃で5分間インキュベート℃を
- 静かにプレート表面から細胞を分離するためにプレートの側面をノック。プレートの外側にトリプシンを飛散しないように注意してください。
- トリプシンのメディアを5 mLまたはそれに相当する額を追加。
- 反応管に混合物を吸引除去する。
- 3分間1,000 × gで遠心する。
- ペレットを乱さないように注意してメディアを、吸引除去する。
- メディアの10mLに再懸濁します。
- チャンバースライドの各チャンバーにメディア400μLを加える。
- 各チャンバーに細胞懸濁液5μLを加える。
- 37℃インキュベーターで一晩増殖℃、5％CO 2で。
6。サンプルへの病原体のほか
- チャンバーへの関心のラベルが付いた病原体のピペットで5〜10μlの（手順1〜3から）。
- アップペッティングでよく混合し、ダウン、付着したマクロファージを乱さないようにチャンバーの底部に触れないように注意してください。
7。ディスク共焦点顕微鏡を回転にサンプルをロードする（ビデオでは、コンポーネント全体をスキャン）
- 回転するディスク共焦点顕微鏡にすべてのコンポーネントの電源をオンにします。
- DICイメージングのための顕微鏡を合わせます。
- インキュベーターからチャンバースライドを削除します。
- 専門的な段階にチャンバースライドを挿入します。
- チャンバースライド（DICイメージングのために必要）の上部を取り外します。
8。光トラッピングのための準備が（ビデオでは、コンポーネントをスキャンし、それがどのように顕微鏡に統合されている）
- 光学トラップのためにシャッターをオンにします。
- IRレーザーをオンにします。
- 光トラップにシャッターを（レーザー）を開きます。
- IRレーザーの前でシャッターを確認するにはIRカードで確認することで閉じられます。
9。光トラップによる病原体の選択と操作
- 付着したスライド上にマクロファージに焦点を当てる。
- マクロファージに隣接する溶液中で自由に変動する病原体を見つける。
- 病原体は、トラップの近くにあるようなステージを移動する。
- シャッターを開いて、トラップを従事する。
- 固定トラップと接触マクロファージを持って来るためにサンプルを移動するペッドの病原体。
- DIC、蛍光、またはその両方の組み合わせのいずれかで、ディスク共焦点顕微鏡を回転すると画像。一般的に、トラップはDICで行われ、リアルタイムイメージングは、蛍光で行われます。
10。代表的な結果：
in vivoおよび in vitro の環境での病原体とビーズの完全な空間的、時間的なコントロールを発揮するために、我々は、回転するディスク共焦点顕微鏡（図に示す回路図1）に統合された特注のトラップ装置を考案。完全な強さで、レーザーはパワー350 mWを提供し、光学トラップ装置内に様々な光学部品と光をカップリングした後、のようなパワーメータで測定した全反射の目的での電力の約80 mWのは、、トラップを形成するために使用されチャンバーインチ
トラッピングレーザーと静止閉じ込められたオブジェクトを保持している間に閉じ込められたオブジェクトへの相対的なチャンバー内のオブジェクトを配置するためには、ステージが移動されました。ステージは、捕捉粒子上にドラッグ力が最大トラッピング力を超えないように、ゆっくりと十分な速度で移動させた。
C. albicansの独立した個体群（典型的なサイズ- 〜5μm）を、複数の蛍光チャネルでイメージングを説明するために三色のそれぞれ（AF488、AF568、AF647と、緑、青、に対応すると図中の赤、それぞれ）で標識した同時に光学的に病原体をトラッピングしながら。シングルC.灰色の矢印で示すようにカンジダアルビカンスはさらに混雑した環境でのオペレータによって選択された単一の病原体の特定の場所（図2A）をキャプチャし、操作する能力を示す、、他の酵母のクラスタを通じて、正方形のパターンの中に閉じ込めと移動された。
病原体が示すさまざまな形の形態をトラップするために、このシステムのさらなる柔軟性を説明するために、光ピンセットにもCを保持して位置づけることができたpseudohyphaeとアルビカンス粒子。 C. AF647（赤）で標識されたアルビは、白い矢印で概説し、蛍光GFP - LC3 - RAW細胞（図2B）の隣に置かれたとして軌道に沿って移動されました。 C.の酵母の部分pseudohyphaeが一緒に後塵としてアルビカンスがトラップされました。
また、この特定の細胞株と病原体（図3A）と貪食の絶対的な時間枠を分析するためにRAWマウスのマクロファージ細胞の隣にアスペルギルスフミと位置づけ。一度病原体が細胞に接触する、トラップがオフになっている、とタイムラプスイメージングが（図3B）、その後の細胞事象を観察するために用いられる。光トラップは一次T細胞は、血液から分離し、ビーズ（図4）と免疫学的シナプスを形成するT細胞ために、抗CD3抗体でコートされたビーズに隣接向け、追加を表示するキャプチャするために使用されていました直接免疫細胞をトラップして操作する汎用性。
図1を組み合わせた光学トラップと回転するディスク共焦点顕微鏡のセットアップの概要と回路図。トラッピングビーム（紫）、電子乗算電荷結合素子（EM -明イメージング（オレンジ色）、蛍光励起ビーム（赤）、蛍光発光（緑）、電荷結合素子（CCD）カメラ用の照明のパスを示す計器のレイアウトCCD）カメラ、ダイクロイックミラー（D1とD2）、ミラー（M1とM2）、及びレンズ（L1、L2、L3、L4）。トラップ - 共焦点顕微鏡システムの他のすべてのコンポーネントは、図のラベルが付いています。
図2（A）の蛍光画像は、トラップとCを操作アルビカンス 。他の蛍光標識Cのフィールドに閉じ込められた蛍光標識（のAlexa Fluor ® 488（AF488）、青）の生物アルビカンス （AF568、緑とAF647、赤）。舞台は、灰色の矢印で示されるトラップ、青州の粒子の周りに移動されます。 C.の（B）閉じ込められた疑似菌糸形GFP - LC3 RAW細胞の隣にアルビカンス 。 CAの蛍光標識psuedohyphalフォーム（赤、AF647）光学的にトラップし、GFP - LC3の隣に移動するには、RAWマクロファージを表明した。白い矢印で示すように、CAの生物は、軌道に沿って移動する。
図3。トラップとAのポジショニング食RAWセルの隣のフミ 。トラップAの（A）明視野像フミ 、のように赤い矢印で示される経路に沿って移動すると位置付け、白い矢印で示されている。トラップされた病原体が少し外側にわずかに焦点面上に生物を押してトラップに起因する焦点のです。A.それは、目的のRAW細胞に隣接して配置されるまで、 フミが移動されます。 （B）インフルエンザA.の食作用のorescenceイメージングRAW細胞からフミ 。トラップされた病原体がRAW細胞の隣に配置された後、食作用のプロセスが起動されます。 30秒で、RAW細胞の膜は、粒子の周りにコップを変更し、形成するために開始されます。 60秒で、カップが完全に形成される。 90年代から150S、Aにフミが包まれている、と180秒で、粒子が完全に内面化され
図4。抗CD3コーティングしたビーズでシナプスを形成する主要なT細胞をトラップする。一次T細胞のDIC画像は、抗CD3抗体とビーズコーティングの隣に位置する光トラップによる移動。セルは、画像に簡単に識別することができない免疫学的シナプスを形成する。