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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 2つのバイポーラ電極を持つヘッドセットの作り方(図1)
- ポリテトラフルオロエチレンでコーティングしたステンレス線を3.5cmカットします。
- 両端のワイヤーから絶縁被覆の約1mmを剥がします。ワイヤーを剥がしすぎないでください。
- ピンの底部が長いスリットが下を向くように、バイスホルダーに2本のピンを置きます。
- ワイヤの被覆を剥がした端とピンの上部にフラックスを塗布します。
- ワイヤーの剥がれた部分を、コーティングするのに十分なはんだで錫メッキします。
- ピンの上部にはんだを最小限の量で追加し、側面にオーバーフローしないようにします。
- はんだが溶けている間、ワイヤの剥がれた端の一方の端をピンにできるだけ深く配置します。
手記：ワイヤーが出てくる可能性のあるサイドホールがあります-ワイヤーがピンから出ないようにしてください。被覆を剥がされたすべてのワイヤは、ピン内に留まる必要があります。
- 2 番目のピンに対して手順 1.6 から 1.7 を繰り返し、今度はワイヤのもう一方のストリップされた端を使用します。
- ピンを30秒間置いてセットし、バイスホルダーからピンを取り外してから引っ張って、ワイヤーとピンの間の接続が強く保持されていることを確認します。
- ピンを冷水ですすぎ、乾かします。
- 抵抗計を使用して、ピン 1 とピン 2 の間のコンダクタンスを確認します。
- ワイヤの両端にあるピンを合わせ、平行に近づけます。止血剤をワイヤーの中心に固定します。次に、止血器を回転させて、ワイヤーがかなりきつくねじれるようにします。止血剤を取り外します。
- ピンの2mm下にあるツイストワイヤーに鉗子をクランプし、ワイヤーを90°に曲げます。
- 同じワイヤーを鉗子の上に再び90°押し戻して、最初から1mm別の曲がりを作成します。
- ねじれたワイヤーを、小さな鋭利なハサミで3.5mmの曲がりから45°の角度で切断します。
- ヘッドセットごとに、これらのバイポーラ(ダブルピンツイスト)電極を2つ用意します(オプションで、1つ目の電極に電気的な問題が発生した場合のバックアップとして、2つ目の電極を用意します)。
- 両端にピンをはんだ付けしたワイヤーを2つに切断して、1つの参照電極を準備します(図1Aのステップ1.1-1.17)。
- ワイヤーを7mmで切断します。
- 先端を先端から1mm下で曲げます。
- 次に、ワイヤーの1mmの曲がった先端を鉗子で覆い、鉗子の周りでワイヤーをしっかりと回転させて小さなループ(直径1mm)を作成します。
- ループをワイヤーの直線部分に対して垂直に曲げて、ワイヤーの先端を再び外側に向けます。
- 2つのバイポーラ電極と1つの参照電極を6ピン台座に組み立てて、バイポーラ電極が6mmの距離で並んでおり、参照電極が中央の外側の穴に配置されるようにします(図1B)
手記：別の方法は、電極を埋め込み、所定の位置にセメントで固定してから、ピンを台座に挿入することです。
>2. 脳定位固定装置の埋め込み
- 手術前にオートクレーブ滅菌により、すべての手術器具と6ピン電極アセンブリを滅菌します。手術中は無菌の手術野を維持する必要があり、滅菌手術用手袋を使用する必要があります。滅菌ドレープ(例:Press n' Seal)は、手術部位を除いて動物を覆うことをお勧めします。
- 離乳後 8 週間齢の VGAT-Cre マウス (水疱性 GABA トランスポーター [VGAT] 遺伝子の制御下で Cre リコンビナーゼを発現し、年齢が一致し、雄と雌の両方) を手術に使用します。手術前に動物の体重を記録して、術後の体重減少を測定できるようにします。
- 認定されたイソフルラン気化器または精密シリンジポンプ、統合デジタル気化器、およびフィードバックヒートパッドを備えた低流量麻酔システムを使用してください><。
手記： 低流量システムは、動物のサイズに比例した低流量で麻酔を誘導チャンバーまたは定位固定装置フレームのノーズコーンを介して送達することができます(70 mL/分、空気中のイソフルラン濃度は誘導で4%、手術で2%)。麻酔の使用を減らすことは、手術中の動物に利益をもたらすだけでなく、実験室の職員がイソフルランにさらされるリスクも軽減します。
- 麻酔をかけた動物を37°Cに温めた加熱パッドの上に置いて、手術中に暖かく保ちます。フィードバック制御温度システムを使用する場合は、手術中の温度監視のために、軽く潤滑された温度プローブを動物の直腸に挿入します。
- 耳棒を耳に、前歯を切歯棒にそっと配置して、動物を定位固定装置フレームに取り付けます。適切な麻酔を提供するために、ノーズコーンを鼻の上に置きます。ヘッドが水平で中央にあり、少しプローブしたときに動かないようにしてください。
- 水分補給のために0.5mLのノルモソールを皮下注射します。.
- 角膜の乾燥を防ぐために眼用潤滑剤を塗布します。
- 後肢のつま先をつまんだ後の離脱反射がないことで麻酔の深さを監視し、手術中にイソフルランを1.5%〜2.0%に減らします。
- 摘み取るか、バリカン(シェービング)または脱毛クリームを使用して手術部位とその周辺の毛を取り除き、ヨウ素とエタノールを交互に3サイクル塗布して皮膚を消毒し、ヨウ素で仕上げます。手術部位から髪の毛を取り除くことは、その場所で麻酔を維持する手段がある場合にのみ推奨されます。必要に応じて、アルコールに浸したコットンチップアプリケーターを使用して、頭のすぐ周りの髪を取り除きます。0.05 mLの局所鎮痛剤ブピバカイン(0.25%)を皮下に注射します。.
- メスを使って頭蓋骨を切開し、鋭利な手術用ハサミで皮膚の一部を切り取り、頭蓋骨を露出させます。綿棒を使用して皮膚を脇に押し、視界を遮っているすべての筋肉と下にある組織から頭蓋骨をきれいにします
手記： 偶発的な出血を防ぐには、滅菌綿棒で出血部位が止まるまで圧力をかけます。
- 滅菌綿棒を使用して過酸化水素で頭蓋骨を洗浄し、頭蓋骨の縫合糸とブレグマとラムダの両方が見えるようにします。
- 頭蓋骨を完全に乾かしてから、アプリケーターを使用してセルフエッチング歯科用接着剤を1滴塗布します。頭蓋骨にブラシで塗り、60秒待ってから、歯科用UVライトで40秒間硬化させます。光沢のある表面は、接着剤が頭蓋骨と効果的に架橋されていることを示します。
手記：この手順は、ヘッドセットをしっかりと取り付けるために重要です。
- 0.031インチのドリルビット(0.79 mm)を使用して、海馬深さ電極(約5,000 rpm)を埋め込むために両側に2つのバリ穴を開けます。ラムダの後ろの小脳の上にある参照電極用に1つの余分なバリ穴を開けます.
注意: 穴を開けるときは、ドリルをゆっくりと下げ、脳に穴を開けないように注意してください。
- 電極の座標は、(mm単位のbregmaから):海馬電極は後方3 mm、側方3 mm、深さ3 mm、小脳参照電極は後方6 mm、側方0 mm、深さ0 mm(硬膜下)です。
- 精度を上げるには、定位固定装置に取り付けられたドリルを使用し、bregmaに触れたときに定位固定装置のX/Y軸をゼロにします-これが座標の基準点です。
- ヘッドセットを組み立てるには、6ピンの台座にすべての電極を挿入し、ピンが台座の奥まで押し込まれていることを確認します。台座を定位固定装置フレームの電極ホルダーに取り付けます(図1B)。
- 電極を対応するバリ穴の上に位置合わせします。ヘッドセットをゆっくりと下げて電極をバリ穴に導くことにより、左右の海馬と参照電極にねじれたバイポーラステンレス鋼線電極を脳位
固定的に埋め込みます。
- 海馬ツイスト電極が穴の真上にある場合は、Z軸をゼロにし、ゆっくりと-3.0mmまで下げます。
- 頭蓋骨の表面と電極を歯科用セメントで覆い、頭蓋骨の表面と台座の底の間のスペースを埋めます。皮膚の端は歯科用セメントに隣接しているため、下にある組織が露出したままになることはありません。セメントが乾いて固まるのを待ちます。次に、電極ホルダーを脳定位固定アームから取り外し、ホルダーを台座から取り外します。
- 鎮痛のために0.1 mLのケトプロフェン(1 mg / mL、皮下[SC])を注入し、水分補給のために0.5 mLのノルモソール(SC)の2回目の投与を注入し、動物を定位固定フレームから取り出します。.
- 37°Cに予熱した等温パッドを、ペーパータオルで覆われた空のビバリウムケージに入れます。完全に目が覚めたら、動物を寝具と柔らかい食べ物と一緒に清潔なケージに入れ、ビバリウムに戻します。この時点から、動物はお互いのヘッドセットを噛むのを防ぐために一人で飼育されます。ヘッドセットが動かなくなるのを防ぐためにワイヤーバーホッパーは使用されず、代わりに水筒がケージトップの下側に結び付けられ、寝具にチャウが存在します。
- 手術後72時間、動物に柔らかい食べ物を与え、体重減少と体調スコアを監視します。脱水状態の動物は、脱水状態の場合、0.5 mLのノルモソールを皮下投与できます(体重減少、皮膚膨満感の増加、目の沈み込み)。.ケトプロフェンは、手術後さらに 2 日間、1 日 1 回皮下投与できます (地元の施設動物管理および使用委員会 [IACUC] ガイドラインに従って鎮痛レジメンに従ってください)。動物がケージ内で4〜7日間完全に回復してから、脳波記録システムに移します。
