アン in vivoでイメージングプロトコルが記述されています。手順は、広視野蛍光顕微鏡とTHY1 - YFPトランスジェニックマウスを利用し、CNSのインタフェースを持つPNSと軸索の相互作用が4cm以上の軸索再生の繰り返しイメージングを可能にする。
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この記事について
サマリー
要約
脊髄神経根の損傷によって負傷した一次感覚軸索は、慢性的な痛みや永続的な感覚消失につながる、脊髄に再生に失敗する。脊髄への後根（DR）軸索の再生が後根エントリゾーン（DREZ）、CNSとPNSの間の界面で阻止される。神経損傷に関連する複雑な変更は事後解析から推定されているためDREZで再生を防止する分子や細胞のイベントの我々の理解は、部分的に、不完全です。このような軸索再生のようなダイナミックな細胞プロセスは、、最高の各生きている動物の複数の観測値とのリアルタイムイベントをキャプチャするテクニックを研究しています。 生体内で連続的にニューロンを監視するために我々の能力は、光学系およびマウス遺伝子組換えの革新的な技術革新に起因し飛躍的に増加している。 THY1 - GFPトランスジェニックマウスの数行は、神経細胞のサブセットを遺伝的に異なる蛍光色でラベル付けされている、個々の神経細胞がインビボ 1 で撮像される許可。これらのマウスは、筋肉の2-4と5月7日脳のin vivoイメージングのために広く使用されており、静的解析が解決していないことを生理学的メカニズムに新たな洞察を提供している。生きている脊髄の神経細胞のイメージング研究では、ごく最近になって始めている。リヒトマンと彼の同僚は、最初のワイド視野顕微鏡8,9で負傷した脊柱（DC）軸索を追跡することによって、その実現可能性を示した。深くに位置するDCの軸索のin vivoイメージング多光子、ミクログリアと血管はまた10を達成している。過去数年間、我々は広視野顕微鏡とTHY1 - YFPマウスのHのラインを使用してDRの軸索の再生を監視するためのin vivoイメージングに適用することに先駆けて。これらの研究は、DRの軸索は、脊髄11内に再生成が禁止されている理由についての小説仮説に私たちを導いた。
THY1 - YFPマウスのHラインでは、別個のYFP +軸索は、表面的にいくつかの軸索を同時に監視できるようになる、配置されている。我々はDREZに到着DRの軸索がより頸髄よりも腰椎でイメージングされたことを知りました。本報告では、我々は再生成DRの軸索の成功を長期的かつ繰り返しイメージングを確保するために有用な発見したいくつかの戦略を説明します。これらは、繰り返し挿管と呼吸の中断をなくす手術に伴うストレスや瘢痕形成を最小限にし、光毒性なしに高分解能で安定した画像を取り込む方法が挙げられる。
プロトコル
1。セットアップ顕微鏡とイメージングの準備
- 私たちのイメージングセットまでは、高速シャッターとMetamorphソフトウェアによって制御される冷却CCDカメラとライカMZ16蛍光実体顕微鏡で構成されています。
- ° C、動物の体温の間に、次の手術を維持するために、サーモスタット制御の加熱パッドを準備し、32.5に出力を調整します。
- 32.5℃まで手術中の脊髄の灌漑のための事前に暖かい滅菌リンゲル液または人工脳脊髄液（ACSF）。
- キシラジン（8 mg / kgの）とケタミン（120 mg / kg）のカクテルの腹腔内注射で動物を麻酔。
- 小動物のバリカンで背中を剃ると綿棒で剃毛面積以上の脱毛ローションの小さなドロップを広げる。分後、70％エタノールに浸したガーゼのスポンジを使用して適用ローションを削除します。
2。椎弓切除およびL5背根の外科的露出
- 温水（32.5 ° C）パッドの上に動物を配置し、70％エタノールに浸した綿棒で皮膚を消毒する。
- 背中の皮膚に - 実体顕微鏡で明視野照明の下、正中切開（3センチ〜2）を実行。必要に応じて、出血を止めるために綿棒を使用してください。
- 基本的な腰椎を公開するために脊髄の筋肉組織を反映している。
- 右両面半椎弓切除は、小さなrongeursを使用してL3 - S....
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ディスカッション
それはその後のイメージングセッションで複数の手術侵襲と麻酔薬の手続きが続く広範囲に軸索の成長を監視するためにかなりの背側椎弓切除を必要とするため、直接生きているマウスのイメージングDR再生は特に困難である。いくつかの戦略は、これらの課題を克服する助け。最初に、成功したイメージングは、麻酔や出血の持続期間を最小限に抑えることにより、マウスの死亡率を（約25％）の削減が必要、と細心の術後のケアで。死亡率はまたすぐに挿管や呼吸を中断することなく複数の画像を取得するための高速カメラの速度を許可する設定を使用して減少した。露出コードに傷の蓄積を防止することも不可欠でした。これらのコラーゲン傷跡は、イメージングのセッション間で急速に開発し、硬膜の表面に薄いが不透明な層を形成する。除去は、退屈です画像のセッションを延長し、血管系と軸索の損傷をリスク。傷跡の除去のための効果的な戦略はしっかりと露出コードに付着し、傷跡が膜ではなく、硬膜上に蓄積させた薄いマトリクス膜を適用することでした。ために外科的処置とphotoxicityからアーティファクトによる交絡の影響の可能性がある、我々は、繰り返しイメージングや手術をせず、マウスで軸索のプロファイルを検討.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
我々は、コメントと編集のヘルプは博士アランテスラーに感謝。この作品は、NIH NS062320によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| HラインTHY1 - YFP（2-4ヶ月齢、雌雄） | ジャクソン研究所（バーハーバー、ME） | 003782 | |
| キシラジン（AnaSed注射、滅菌溶液） | ロイド研究所、（シェナンドア、LA） | 4811 | 8 mg / kgを |
| ケタミン（塩酸ケタミン注射、USP） | ホスピーラ社（レイクフォレスト、イリノイ州） | 2051 | 120 mg / kgの |
| ブプレノルフィン（注射Buprenex）（0.05 mg / kg体重） | レキットベンキーザーティカルズ社（リッチモンド、バージニア州） | 7571 | |
| 小動物のバリカン | オスタープロフェッショナル、（マックミンヴィル、テネシー州） | 76059-030 | |
| 脱毛ローション | 教会＆ドワイト共同（プリンストン、ニュージャージー州） | ベビーオイルとNairさん | |
| ガーゼのスポンジ | フィッシャーサイエンティフィック、（ピッツバーグ、ペンシルバニア州） | 22-362-173 | |
| 綿棒 | フィッシャーサイエンティフィック、（ピッツバーグ、ペンシルバニア州） | 14から960 - 3Q | |
| 1 mLのシリンジ | ベクトン、ディクソンと会社フランクリンレイクス、ニュージャージー州） | 309602 | |
| 皮下（サブQ）針、26ga。 | ベクトン、ディクソンと会社（フランクリンレイクス、ニュージャージー州） | 305115 | |
| 春のはさみや鉗子 | ファイン科学ツール、（フォスターシティ、カリフォルニア州） | ||
| 2.5 mmの湾曲したrongeurs | ファイン科学ツール、（フォスターシティ、カリフォルニア州） | 16221〜14 | |
| 乳酸加リンガー液USP | B. Braunはメディカル株式会社、（アーバイン、カリフォルニア州） | BBR - L7502 | |
| 滅菌生理食塩水 | APPファーマシューティカル（シャンバーグ、イリノイ州） | 918610 | |
| 薄い合成マトリックス膜（Biobrane） | Bertek医薬品、（ウェストバージニア州モーガンタウン） | 62794-096-251 | |
| 人工硬膜 | ゴアは、MVPデュラエースの代替、WLゴア＆アソシエイツ、（フラッグスタッフ、アリゾナ州）を排除してください | 1MVP40 | |
| 5から0絹縫合糸 | エチコン社（サマービル、ニュージャージー州） | K - 580 | |
| 創傷クリップ | パーフェクト - ETSブリュノ、（Burnea、フランス） | A75 | |
| 蛍光実体顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ、（ヴェッツラー、ドイツ） | MZ16 | |
| CCDカメラ | 浜松、（ブリッジウォーター、ニュージャージー州） | ORCA - Rx2の | |
| 温度コントローラ | 世界精密機器（サラソタ、フロリダ州） | ATC 1000年 | |
| Metamorphソフトウェア | Molecular Devices社、（サニーベール、カリフォルニア州） | ||
| フォトショップ | アドビシステムズ、サンノゼ、カリフォルニア州 |
参考文献
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, ....
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