マウス脳切片における誘発性てんかん発作に対する直流刺激の影響

要約

出典:Lu, H., et al. Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、マウスの脳切片のてんかん発作に対する直流刺激(DCS)の影響を評価するための研究を示しています。接続された内側視床 (MT) と前帯状皮質 (ACC) 領域を含む脳スライスは、多電極アレイ (MEA) に配置されます。MTへの電気刺激と発作誘発薬を適用してACCでてんかん発作を誘発し、次にDCSを適用して誘発発作への影響を評価します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 多電極アレイ記録のための実験液と装置の準備

1. 人工脳脊髄液(人工脳脊髄液[aCSF];124 mM NaCl、4.4 mM KCl、1 mM NaH₂PO₃、2 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、25 mM NaHCO₃、および10 mMグルコース、95%_O2および5%_CO2で泡立った)を準備します。
2. 6 x 10 planar MEA と 8 x 8 MEA の 2 種類の MEA プローブを使用します。前者のプローブは、皮質、線条体、視床を構成する領域をカバーしています。後者のプローブは皮質領域のみをカバーします。
3. バンドパスフィルタを0.1Hz〜3kHzに設定した60チャンネルアンプを1,200アンプで使用します。10 kHzのサンプリングレートでデータを集録します。
4. DCS用のMEAチャンバー内に2本のAgClコーティングされた銀線を配置します。AgClでコーティングされた銀線を使用して、孤立した刺激装置によって生成される電界を生成します。
5. 視床刺激用のタングステン電極(直径127μm、長さ7.62cm、先端が8°ACテーパー、抵抗、5MΩ)を配置し、参照電極をMEAチャンバーに配置します。パルス発生器によって制御される絶縁刺激装置を使用して、タングステン電極の電流を供給します。

2. 脳スライスの準備

1. 4-8週齢の雄のC57BL/6Jマウスを使用してください。エアコン完備の部屋(21-23°C、湿度50%、12時間/12時間のライト/ダークサイクル、8:00 AM点灯)に動物を収容し、餌と水を無料で利用できます。
2. ステップ1.1で調製したaCSFの250mlアリコートを取り、氷が入ったビーカーに入れます。同時に、95%の_O2と5%の_CO2で構成される連続ガスを供給します。
3. 手術
   1. ガラスの箱に4%イソフルランを入れて動物に約3分間麻酔をかけます。動物が外科的な麻酔深度に達したら(つま先のつま先をつまむ反応がないことが示されます)、砕いた氷で満たされた浅いトレイに置き、ハサミで頭を取り除きます。
   2. 頭蓋骨を露出させ、残りの筋肉を切り取ります。次に、ロンゲールを使用して、頭蓋骨の背側表面を脳から剥がします。ロンジャーを使用して頭蓋骨の側面を切り取ります。すべての手術器具を75%エタノール溶液で滅菌します。
   3. へらを使用して、脳の腹面に沿って嗅球と神経接続を切断し、脳を切除します。斬首後、氷冷酸素化aCSFで満たされたビーカーに脳を迅速に移します。
4. MT-ACC Brain Slice
   の調製 手記：MT から ACC への経路を含むスライスを準備します。
   1. 各半球の正中線から2.0mm外側の2つの矢状カットで脳ブロックを手でカットし、皮質下の解剖学的構造を表示します。次に、2つの角度のあるカットを行います。最初のクロスカットを線条体の目に見える繊維路と平行にします。
   2. 小脳と視覚野の間の接続から、視床帯状経路に平行で腹側にある前交連と視路の中点まで、2 番目のクロスカットを作成します。
   3. シアノアクリレート接着剤で脳ブロックを角張ったプレート(~120°)に取り付け、経路のターニングポイントのすぐ上に切り込みを入れます。プレートを広げて平らにし、ビブラトームのチャンバーステージに接着します。
   4. 内側視床-ACC脳スライス(厚さ500μm)を作成し、氷冷した酸素化aCSFに浸します。スライスを記録チャンバーに移し、酸素化aCSFを含む連続灌流(12 mL/分)で32°Cに1時間保持します。

>3. 多電極アレイ記録用灌流チャンバーの作製

1. 灌流チャンバーの準備
   1. MEAプローブをマルチチャンネルシステム上に置き、2本の別々のポリエチレンチューブを使用してプローブを蠕動ポンプに接続します。一方のチューブを使用して aCSF を MEA チャンバーに誘導し、もう一方のチューブを使用して aCSF をチャンバーからガイドします。最後に、温かい(29-30°C)酸素化aCSF(8 mL/分)で調製物を連続的に灌流します。
2. 脳スライスをMEAに移します。濡れた綿棒を使用して、MEAで脳スライスを保持します。ブレインスライスを慎重に動かして、ACCが電極の上に向けられるようにします。
3. スライスアンカーキットとホールドダウンを使用して、ブレインスライスを押します。このステップにより、スライスと電極間の良好な電気的接続が保証されます。

4. DCSによる電界の生成

>注: 電界の向きの定義は、ACC の軸突起軸の方向に基づいていました。樹状突起と体細胞のコンパートメントの向きは、ゴルジ染色を使用して確認されました。

1. AgCl電極(アノードとして定義)をACCの近位に配置し、もう一方の電極(カソードとして定義)をACCの遠位に配置します。MEAによる2つの磁場配向(ACC軸突起繊維に平行および垂直)によって生成される電界強度を記録し、刺激装置を使用して電界の電流を供給します。
2. AgCl電極の距離(約1.5〜2cm)を固定し、刺激装置の電流強度を調整してDCSを0.5〜2mAにします。

>5. 電気的に誘発される皮質シナプス反応

注:MTの電気刺激によってACCのシナプス応答を誘発します。MTでは、プログラム可能な電気刺激発生器が長方形の二相性電流パルスを生成します。

1. 上記のセクション3を繰り返します。
2. MTにタングステン電極を配置し、刺激装置からバイポーラタングステン電極を介してスライスの視床領域にパルスを送達します。
3. さまざまな電流強度を使用して、ACC 応答を引き出すしきい値を決定します。ここでは、強度±150μA、持続時間を200μsecとすると、ほとんどのスライスでACCの最大応答が80%引き出されました。
4. MT-ACCスライスの視床帯状回経路(MTから脳梁まで)に沿ってタングステン電極を移動させ、最適な応答プロファイルを取得します。
5. ACC応答を10〜20回スイープし、ソフトウェアを使用して、MT刺激によって誘発されたすべてのACCを自動的に平均化します。その結果、MT-ACC経路によるMT刺激から誘導されたACCのシナプス応答が得られました。

6. 電気的に誘発される発作様活動

注:発作様活性は、4-アミノピリジン(4-AP;250μM)とビキュクリン(5μM)の適用によって誘発されました。以前の時間管理研究では、薬物投与の2〜3時間後に最大かつ安定した反応が現れたことが示されました。

1. 上記のセクション5を繰り返します。
2. 灌流液に薬を追加します。4-AP(250μM)とバイキュクリン(5μM)を使用してください。薬物を均一に混合し、2〜3時間灌流を続けます。
3. 発作様の活動を促進するには、灌流ポンプを比較的速い灌流速度(8 mL/分)に維持することで、pH勾配の蓄積を防ぐこともできます。
4. MTにタングステン電極を配置し、電気刺激(150μA、持続時間200μsec)を照射してACC応答プロファイルを取得します。
5. 10-20回のスイープを行い、応答を平均化します。
6. 灌流液を新鮮なaCSFと交換して、薬剤を洗い流します。手順6.5を繰り返します。

7. 誘発された皮質反応に対するDCSの効果のテスト

1. セクション3と4を繰り返します。MEAチャンバー内に配置された2本の平行なAgClコーティング銀線間に電流を流すことにより、均一な電界が生成されるようにします。問題がない場合、DCSは0.5〜2mAに留まります。
2. DCSをオフにし、視床を刺激するためのタングステン電極を配置します(±150μA、200μsec持続時間)。ACCで最大のシナプス応答を得るには、10〜20回のスイープを行い、応答を平均化します。
3. DCS(2 mV/mm DCS強度)と視床刺激(350 μA、持続時間200 μsec)を同時にオンにします。DCS 中の視床刺激誘発 ACC 応答の振幅の変化を評価します。
4. DCSをオフにし、4-AP(250μM)とバイキュクリン(5μM)を灌流溶液に加えます。その後、2〜3時間待ちます。薬が脳スライスに影響を与えると、スライスは皮質発作反応を引き起こします。
5. ACC応答を10〜20回スイープし、電気的に誘発された皮質発作反応の振幅と持続時間を測定します。
6. 手順7.5の後、DCS(2 mV / mm DCS強度)と視床刺激(150 μA、200 Duration μsec)を同時にオンにします。DCS適用中に誘発された皮質発作反応の振幅と持続時間の変化を評価します。
7. 灌流溶液を新しいaCSFと交換して薬剤を洗い流し、手順7.2と7.3を繰り返します。
8. すべての記録データを収集し、データをさまざまな実験条件にグループ化します。さまざまな実験条件下での皮質発作反応の振幅と持続時間を評価します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔剤：
イソフルラン	ハロカーボンプロダクツ株式会社	NDCの12164-002-25	4%
aCSF(合計:1 L):
D(+)-グルコース	メルク	1.08337.1000	10 mM
炭酸水素ナトリウム	メルク	1.06329.0500	25メートル
塩化ナトリウム	メルク	1.06404.1000	124 mM
(+)-ナトリウムL-アスコルビン酸、>= 98%	シグマ	A4034-100Gの	0.15 g/2 cc(約2 c.c.)
硫酸マグネシウム、無水、ReagentPlus	シグマ	M7506-500G	2 mM
塩化カルシウム二水和物	メルク	1.02382.1000	2 mM
リン酸二水素ナトリウム一水和物	メルク	1.06346.1000	1 mM
塩化カリウム	メイ&ベイカー株式会社、ダゲナム、イングランド	MS 7616	4.4メートル
薬：
(+)-バイキュクリン	トクリス	130	5 μM in aCSF
4-アミノピリジン	トクリス	940	250 μM の aCSF
脳スライスの準備:
ビブラトーム	ビブラトーム	1000系	500 μmの厚さのスライスにブロックスライス
MEAシステム:
多電極アレイ(MEA)プローブ:6 x 10平面MEA	マルチチャンネルシステム	60MEA500/30iR-TI-PR MEAS 6x10	電極径、30 μm、電極間隔、500 μm、インピーダンス、200 Hzで50 kΩ
多電極アレイ(MEA)プローブ:8 x 8 MEA	アヤンダバイオシステムズ	60MEA200/10iR-Ti-PR MEAS 8x8	ピラミッド型電極、直径40μm、先端高さ50μm、電極間隔200μm、インピーダンス1,000kΩ(200Hz)
60チャンネルのアンプを使用し、バンドパスフィルタを0.1Hz〜3KHzに設定、1,200倍の増幅率で使用しました	マルチチャンネルシステム	MEA-1060-BC
10KHzのサンプリングレートのMC Rackソフトウェア	マルチチャンネルシステム		データ収集と記録のためのソフトウェア
・パルス発生器の制御	マルチチャンネルシステム	STG 1002
スライスアンカーキットとホールドダウン	ワーナー・インストゥルメンツ	SHD-26H/10;ウィスコンシン64-0250
蠕動ポンプ-ミニパルス3	ギルソム	MINIPULS3	灌流速度:8 ml /分
刺激システム:
絶縁刺激装置	A-Mシステムズ	モデル2100	強度±350μA、持続時間200μsec
タングステン電極	A-Mシステムズ	575300	thalamusに置かれる

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