ショックチューブ装置を用いた脳切片における外傷性損傷の誘発

要約

出典:Campos-Pires, R., et al.爆風外傷性脳損傷の新規in vitroモデル。J. Vis. Exp.(2018年)

この動画では、衝撃管装置を使用して、制御された加圧によってポリマーダイアフラムを破裂させることで衝撃波を発生させています。衝撃波は、固定されたバッグに収められた脳スライスに衝撃を与え、脳スライスに外傷を誘発します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 海馬の器官型スライスの準備と培養

>注:このプロトコルは、器官型の海馬スライスの生産を可能にします。理想的には、1回のセッションで3匹以下の動物を安楽死させて解剖し、各ステップが迅速に行われるようにし、スライスの品質を損なわないようにする必要があります。全体を通して無菌技術を使用します。

1. 解剖プロトコルを開始する前に、次の手順が実施されていることを確認してください。
   1. 0.22 μmフィルターを使用して、すべての溶液を事前に調製し、ろ過滅菌します。
   2. 保存中、および脳の解剖と海馬スライスの準備中は、保存容器とシャーレを常に濡れた氷の上に置いた金属製のヒートシンクに置いておくことにより、溶液を4°Cに保ちます。
   3. すべての金属器具、リング、およびペーパーティッシュをオートクレーブします。
   4. プロトコールの各ステップで使用するすべての機器と材料がすぐに使用でき、事前にレイアウトされ、70%エタノールが噴霧されていることを確認してください。その後、冷まして乾かします。
2. 5〜7日齢のC57BL / 6Nマウスの子犬を子宮頸部脱臼で安楽死させ、70%エタノールに浸した滅菌紙ティッシュで皮膚表面全体を短時間拭きます。皮膚を軽くたたいて乾かし、メイヨーハサミを使用して子犬の首を切り落とします。
3. 頭の正中線に沿って、後頭部から鼻の近くまで、虹彩はさみで頭皮の皮膚を切り取り、横方向に引っ込めます。
4. Vannasはさみの先端を大孔に挿入し、横静脈洞に沿って骨に2つの小さな横方向の切り込みを入れ、次に頭蓋骨を正中線に沿って嗅球まで切り込み、この領域の正中線に垂直に2つの小さな切り込みを入れます。
5. 細い湾曲した鉗子を使用して、骨のフラップを正中線から横方向に引っ込めます。小さなヘラで脳を慎重に取り出し、「解剖媒体」が入った90mmのシリコーンエラストマーコーティングされたペトリ皿に移します
   手記：解剖媒体は、Geyの平衡塩溶液(5 mg / mL D-グルコース、1%抗生物質-抗真菌溶液、10,000ユニット/ mLペニシリン、10 mg / mLストレプトマイシン、および25 μg / mLアムホテリシンB)です。
6. 小脳を切除し、カミソリの刃を使用して正中線に沿って大脳半球を分離します。スパチュラを使用して、大脳半球を新しい90mmシリコンエラストマーコーティングされたペトリ皿に移し、新鮮で氷のように冷たい解剖媒体で満たします。1 回のセッションで複数の動物を使用する場合は、手順 1.2 から 1.6 を繰り返します。
7. 実体顕微鏡で嗅球と前頭皮質の先端を剃刀の刃で切り取り、先端の細い鉗子を使って大脳皮質を他の脳組織から分離します。このステップにより、海馬は皮質組織の内側表面に露出したままになります。このステップ以降は、層流組織培養フード(紫外線滅菌し、70%エタノール溶液で洗浄)を使用します。
8. 氷冷した解剖媒体を平らなプラスチック製のチョッピングディスクに適用し、へらを使用して、皮質の内側表面が上を向き、海馬の軸がチョッピングブレードの軸に垂直になるように、脳組織をディスク上に配置します。
9. 細径パスツールピペットを使用して、チョッピングディスクから解剖媒体をできるだけ取り出します。
10. ティッシュチョッパーを使用して、50%のチョッピング速度と力で脳を400μmのスライスに切断します><。 手記：このステップは、脳組織が解剖媒体に沈まないため、できるだけ早く完了する必要があります。
11. シリコーンエラストマーでコーティングされたペトリ皿の解剖媒体を、新鮮な氷冷した媒体と交換します。
12. ティッシュチョッパーが完成したら、脳組織を新鮮な解剖培地に慎重に沈め、切断した組織をストレートブレードメスを使用して90mmシリコンエラストマーコーティングされたペトリ皿に戻します。
13. 実体顕微鏡下で、細い先端の鉗子を使用して皮質スライスを慎重に分離します。スライスごとに、海馬の形態と、解剖またはスライスに起因する潜在的な組織損傷がないか検査します。
14. 海馬を嗅内皮質と糸状皮質から分離し、細い先端の鉗子と小さなバンナスのはさみを使用します。通常、半球ごとに約6〜8個の海馬スライスが生成されます。
15. カットしたパスツールピペットを使用して、最大6つの海馬スライスを組織培養インサートに移し、35mmのシャーレに入れます。スライスが数ミリメートル離れて広がっていることを確認します(これにより、各スライスを個別にイメージングできるようになります)。
16. すぐに氷冷した「成長培地」を各ペトリ皿の底、組織培養インサートの下、組織培養インサートの縁のすぐ下に追加します><。 手記：増殖培地には、50% の最小必須培地イーグル、25% ハンクス平衡塩溶液、25% ウマ血清、5 mg/mL D-グルコース、2 mmol/L L-グルタミン、1% 抗生物質-抗真菌溶液、および 10 mmol/L HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)が含まれており、水酸化ナトリウムで pH 7.2 に滴定されています。
17. 解剖の翌日とその後2〜3日ごとに増殖培地を交換してください(37°Cの増殖培地を使用してください)。増殖培地が十分に添加されていることを確認してくださいが、組織培養インサートメンブレンにオーバーフローして組織スライスの生存率を損なうほどではありません。
18. 実験に使用する前に、組織切片を加湿インキュベーターに37°Cに保管し、5%の二酸化炭素を空気中に12〜14日間保管してください。

>2. 実験的ブラストTBIプロトコルのための海馬器官型スライスの準備

>注:このセクションの手順は、イメージングを除き、層流組織培養フードで行われます。

1. カスタムメイドのステンレス製リングを6ウェルプレート(ウェルごとに1つ)に挿入します
   注:リングにはノッチ付きの縁(12時の位置に収まるはずです)があり、ウェルの内側にぴったりと収まりますが、組織培養インサートはこの縁に簡単にフィットします。リングを殺菌消毒剤で洗浄し、精製水で十分にすすぎ、オートクレーブ滅菌し、事前に冷ましてください。
2. 6ウェルプレートのウェルに、ヨウ化プロピジウムを含む予熱済み(37°C)の血清を含まない「実験培地」を充填します
   手記：ヨウ化プロピジウムを含む実験用培地は、75% 最小必須培地 Eagle、25% ハンクス平衡塩溶液、5 mg/mL D-グルコース、2 mmol/L L-グルタミン、1% 抗生物質 - 抗真菌溶液、10 mmol/L HEPES および 4.5 μmol/L ヨウ化プロピジウムを水酸化ナトリウムで pH 7.2 に滴定します。
3. ミディアムレベルがリングのノッチより上に届かないようにしてください。リング付きの6ウェルプレートをインキュベーターに1時間戻して、組織培養インサートが移される直前に培地が37°Cにあることを確認します。
4. 35 mmシャーレからの器官型スライスを含む組織培養インサートを、リングおよび鉗子付きの実験培地を備えた6ウェルプレートに移します。
5. 3時位置のインサートリムに油性マーカーペンでドットを描きます.
   手記： インサートは、実験中に6ウェルプレートから取り外されます。このステップにより、衝撃波曝露後にインサートを元の位置に戻すことができ、プロトコール全体で各スライスを簡単に追跡できます。
6. 各6ウェルプレートに固有の名前と日付をラベル付けし、各プレートのウェルのマップを作成し、各ウェル(例:A、B、Cなど)と各ウェルの各スライス(例:1、2、3など)に名前を付けて、各スライスに一意の識別子(例:A1、A2、A3など)を持たせます。
7. イメージングの直前に6ウェルプレートをインキュベーターに1時間移し、スライスが37°Cにあることを確認します
   手記：組織培養インサートメンブレンの下に培地や気泡があふれ出ることは、スライスの生存率を損なう可能性があります。
8. 実験培地に移してから1時間後、適切な励起(BP 535/50 nm)および発光(LP 610 nm)フィルターを装着した蛍光顕微鏡(2倍対物レンズ、NA 0.06)を使用して各スライスを個別にイメージングし、損傷プロトコルを実施する前にスライスの健康状態を評価します
   筆記：この段階で濃い赤色染色の領域を示すスライスは、生存率が低下していると考えるべきであり、さらなる分析から除外する必要があります(これらは通常、生成されたスライスの総数の10%未満を表します)。イメージングは、スライスがインキュベーターの外にある時間を最小限に抑えるために、できるだけ迅速に順次実行されるようにしてください(通常、6ウェルのイメージングには30分弱かかります)。
9. 6ウェルプレートの蓋は常に閉めておいてください。蓋の内側に結露が蓄積する場合があります。これが発生した場合は、低設定でヘアドライヤーを短時間使用してください。
10. すべてのイメージング条件が異なる日や実験間で同一であることを確認してください
    手記： イメージングの目的は、組織の蛍光を定量化することです。したがって、このステップは、結果の再現性を確保し、データを比較できるようにするために重要です。

3. 海馬器官型スライスによる組織培養インサートの浸漬と輸送

1. イメージングの直後に、層流フード内で、鉗子を使用して1つの組織培養物を6ウェルプレートから取り出します。
2. 95%の酸素と5%の二酸化炭素で新たに泡立たせた20mLの温かい(37°C)実験用培地をあらかじめ充填した滅菌ポリエチレンバッグ(3インチ x 5インチ)にインサートを慎重に移します
   手記：酸素と二酸化炭素が豊富な実験培地を、Dreschel ボトル内の焼結ガラスバブラーを使用して 95% の酸素と 5% の二酸化炭素で少なくとも 40 分間泡立て、バクテリアフィルターと滅菌充填チューブ (127 mm) が取り付けられた 20 mL シリンジを使用して、層流組織培養フード内の滅菌ポリエチレンバッグに移していることを確認します。すぐにバッグを密封し、組織培養インサートを移す前に少なくとも1時間、37°Cのインキュベーターに移します。
3. 各滅菌バッグに正しくラベルが貼られていることを確認してください(プレートとウェルの識別が記載されています)。各組織培養インサートについて、この手順を繰り返します。滅菌バッグを密封する際には、気泡を慎重に排除します(バッグの上部をひねり、プラスチッククランプを適用することによりしっかりと行います)。
4. 組織培養インサートを入れた滅菌バッグと実験培地を入れた6ウェルプレートを37°Cインキュベーターに戻します。
5. 1時間後、37°Cの脱イオン水で満たされた温度調節されたボックス内のプラスチックボックス内のプラスチックボックスに滅菌バッグを慎重に詰めて、衝撃波曝露プロトコル全体を通じて器官型スライスを生理学的温度に保ちます。

>4. 衝撃波曝露と海馬器官切片スライスの衝撃波曝露の準備

1. スチールトゥの保護ブーツ、白衣、手袋を着用して、ショックチューブを準備し、衝撃波を露出させます。
2. 滅菌バッグホルダーフレームをショックチューブ遠位フランジにボルトで固定し、中央の穴がショックチューブ出口と位置合わせされていることを確認します(ブランキングロッドを使用)。
3. 2つの圧力トランスデューサを放射状に取り付けます:センサー1は被駆動部の中央部分に、センサー2はショックチューブの遠位フランジにあります(図1A)。圧力トランスデューサを電流源電源ユニットを介してオシロスコープに接続します。
4. すべてのショックチューブリリースバルブとフローコントロールが閉じていることを確認してください。
5. 外部圧縮空気ラインを開き、ソレノイドバルブを2.5バールまで充電します。
6. 圧縮空気シリンダーの安全弁を開き、圧力調整器をゆっくりと開いて、圧力を約5 bar.
   に上げます。 注意: このレギュレーターに設定された圧力は、ダイヤフラムの最高破裂圧力をわずかに上回る必要があります。
7. 厚さ23μmのポリエステルシートを10 x 10 cm2の正方形にカットして、ダイヤフラムを準備します。オートクレーブテープを使用してハンドルを準備し、各ダイヤフラムの上下に貼り付けます。
8. 1つのダイヤフラム(ダブルブリーチのシングルスロット-シングルダイヤフラム構成)または2つのダイヤフラム(ダブルブリーチの両方のスロット-ダブルダイヤフラム構成)をブリーチに配置します(図1B)。
9. ダイヤフラムを中央に配置し、4つのM24ボルトとナットを使用してクランプし、斜めに対称な方法で順番に固定し、ダイヤフラムにしわが寄らないようにします。
10. 各滅菌バッグをホルダーフレームの垂直位置に個別にクランプし、器官型の海馬スライスを含む組織培養インサートの表面がショックチューブ出口に面し、組織培養インサートが滅菌バッグの中央に配置されていることを確認します(図1C)。滅菌バッグが全周にしっかりと固定されていることを確認し、しっかりと
固定します。
11. ショックチューブを押すときは、イヤーディフェンダーと安全メガネを着用してください。電流源の電源ユニットとオシロスコープの電源を入れて、衝撃波データ(集録レート50メガサンプル/秒、レコード長20ミリ秒、100万ポイント)を取得し、電磁弁を閉じます。
12. ショックチューブコントロールパネルのフローコントロールノブを使用して、シングルダイヤフラム構成の場合はショックチューブのドライバーボリュームセクションを、ダブルダイヤフラム構成の場合はショックチューブのドライバーボリュームセクションとダブルブリーチセクションの両方をゆっくりと加圧します。
    手記：シングルダイヤフラム構成の場合、破裂圧力はダイヤフラムの材質と厚さにのみ依存し、材料の破裂圧力に達するとダイヤフラムは自発的に破裂します。ダブルダイヤフラム構成の場合、破裂圧力はドライバーとダブルブリーチチャンバーの両方のガス圧力差にも依存し、ダイヤフラムが制御された方法で破裂するためには、目標圧力に達するとダブルブリーチ安全弁が手動で開きます。
13. ダイヤフラムが破裂して大きな音がしたらすぐに、フローノブを使用して圧縮空気の流れをすばやく閉じ、電磁弁を開きます.
    手記：ドライバーセクションの総体積は、ブランキングセグメントの挿入によって変更でき、衝撃波のピーク過圧と持続時間をより広い範囲で得ることができます。衝撃波パラメータの理想的な組み合わせは、組織の損傷を引き起こすのに十分であるべきですが、組織培養の挿入や滅菌バッグの歪みや破裂を引き起こすほど高くはありません。
14. 各滅菌バッグを組織培養液で露出させ、単一の衝撃管波に挿入し、すぐに温度調節ボックスに戻してから、新しい滅菌バッグをボックスから取り出してホルダーフレームに固定します。37°C未満の温度は損傷の発生を妨げる可能性があるため、実験用培地が冷えるのを防ぐために、ステップ4.10〜4.14ができるだけスムーズかつ迅速に(数分以内に)実行されることを確認してください。
15. すべての組織培養インサートを衝撃波(または偽のプロトコル)にさらしたら、それらを元の6ウェルプレートとそれぞれのウェル(層流組織培養フード内)に戻し、インキュベーターに戻します。
16. 6ウェルプレートをインキュベーターに保管し、5%の二酸化炭素を37°Cの空気中に置き、さらにイメージングします。
17. 各実験の偽コントロールとスライス衝撃波曝露を含めます.
    手記： 偽のスライスは、衝撃波にさらされたスライスと同じように処理されます(実験用媒体と一緒に滅菌バッグに密封され、同じ温度調節されたボックスでショックチューブ実験室に輸送され、金属フレームに一定時間吊り下げられます)が、ショックチューブは発射されません。

結果

図1:滅菌バッグホルダーフレームを備えたショックチューブ装置の概略図。ショックチューブは、長さ1.22mのセクションを3つ構成した長さ3.8mのステンレス製チューブで、ガスケットとフランジで接続され、内径は59mmです。(B)インセットはダブルブリーチアセンブリを示しています。1つまたは2つのマイラーダイヤフラムは、ゴム製のOリングによって提供されるシールでアセンブリにクランプできます。(C)滅菌バッグホルダーフレーム。フレームの本体は、ショックチューブの出口と一直線に並ぶ中央に円形の穴(直径59mm)を備えた2枚の金属プレートで構成されています。2枚の薄い(4 mm)シリコンエラストマーシートが2枚の金属プレートの間にはめ込まれています。これらのシートの目的は、滅菌バッグをクランプするための均一で滑りにくい表面を提供することです。バッグとショックチューブの出口の間の距離は7cmです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Geysバランス塩溶液	シグマUK	G9779
D-グルコース	シグマUK	G8270
抗生物質/抗真菌薬	シグマUK	A5955
最小必須ミディアムイーグル	シグマUK	M4655
ハンクスバランス塩溶液	シグマUK	H9269-J
馬の美容液	シグマUK	H1138-J
L-グルタミン	シグマUK	G7513
ヘープス	VWR Prolabo(ベルギー)	441476L
水酸化ナトリウム	シグマUK	S-0945
組織培養インサート	ミリセルCM 30 mm ローハイトミリポア	PICM組織50
6ウェルプレート	NUNC, デンマーク	140675
ヨウ化プロピジウム	シグマUK	P4864
滅菌ポリエチレン袋 - Twirl'em滅菌サンプル袋	フィッシャーブランド	01-002-30
ポルテックス エイボン クウィル フィリング チューブ 5インチ (127mm)	スミスメディカルサプライ	E910
落射蛍光顕微鏡	NIKON Eclipse 80i(イギリス)
顕微鏡対物レンズ	ニコンプランUW倍率2倍、NA0.06、WC7.5mm
顕微鏡フィルター	ニコンG-2B(ロングパスエミッション)
マイラー電気絶縁フィルム、304 mm x 200 mm x 0.023 mm	RSコンポーネンツUK	〒785-0782
圧力トランスデューサ	Dytran Instruments株式会社	2300V1
ティッシュチョッパー	Mickle Laboratory Engineering Co.、ギルフォード、サリー州、イギリス。	Mcllwainティッシュチョッパー
シリコーンエラストマー	ダウコーニング、米国	シルガード184

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