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方法論記事

アミロイドペプチド注入によるゼブラフィッシュ脳のアルツハイマー病モデルの確立

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2025年7月8日

この記事について

要約

Bhattarai, P., et al.成体のゼブラフィッシュ脳におけるアミロイドβ42毒性と神経変性のモデル化。J. Vis. Exp. (2017年)。

このビデオは、単量体のアミロイドペプチドを成体のゼブラフィッシュの前脳に注入してアミロイド毒性を発生させる手順を示しています。これは、アルツハイマー病で見られるニューロンの損傷を模倣しています

プロトコル

1. Aβ42ペプチドの調製

  1. 標準的な9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)ケミストリーと2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロノウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)をカップリング試薬として、全自動固相ペプチド合成装置でペプチドを合成します(表1を参照)。合成のスケールは100μmolでした。
  2. 全自動ペプチドシンセサイザーに、固相として500mgのFmoc保護樹脂をロードします(ローディング容量0.2mmol/g)。溶解したFmoc保護アミノ酸を、必要な容量で、それぞれのシンセサイザーで計算された量で0.5 Mの濃度でロードします。
    手記：この計算は、各 Fmoc 保護アミノ酸を 2 回結合し、各ビルディング ブロックを 5 倍過剰に樹脂に結合できるように行われます。
  3. ペプチド合成に必要な試薬をジメチルホルムアミド(DMF)に溶解します。例えば、活性剤HBTUを0.48 M、45% v/v N-メチルモルホリン(NMM)(塩基)、および5% v/v 無水酢酸(キャッピング混合物)の濃度で調製し、未反応のアミノ基をキャップします。
  4. トリフルオロ酢酸(TFA):トリイソプロピルシラン(TIS):水:ジチオスレイトール(DTT)を90(v/v):5(v/v):2.5(v/v):2.5(m/v)で4時間、攪拌機を用いて固体支持体を連続的に混合することにより、樹脂からすべてのペプチドを切断します。
  5. 切断混合物を100 mLの氷冷ジエチルエーテルに添加することにより、切断された生成物を沈殿させます。孔径0.45μmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルターを含むろ過ユニットを通過し、20mLの氷冷ジエチルエーテルで洗浄します。
  6. 濾過したペプチドを濾紙から回収し、100 mgの沈殿ペプチドを5 mLの蒸留脱イオン水(アセトニトリル)に1:1で溶解します。
  7. ビーズサイズ10 μmの多孔質ポリスチレンジビニルベンゼンカラムを搭載したセミ分取HPLC上で、逆相高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製します。
    1. カラムを予熱し、カラム加熱装置を使用して50°Cに維持します。自動フラクションコレクターを使用して、溶媒 B 5% から 100% までのグラジエントを 4 mL/分で 25 分間塗布し、すべての主要なフラクションを回収します
      手記：溶媒Aは水に0.1%TFAであり、溶媒Bはアセトニトリルに0.1%TFAです。
    2. 220 nm のクロマトグラムをモニターし、適切なピークを収集し、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を使用して分析します。
  8. 220 nmの逆相超高圧液体クロマトグラフィー(UPLC)分析法により、サンプルを分析用C18カラム(ビーズサイズ1.7 μm)に通しながら紫外線(UV)検出器でモニタリングし、純度を確認します。質量分析でペプチド生成物を確認.
    手記： UPLCは、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)およびタンデム四重極検出器に結合されています。
  9. 丸底フラスコで目的のペプチドの正しい画分を凍結乾燥するには、ふわふわの粉末に0.052 mbarの真空を適用します。真空ポンプを-78°Cに維持された凍結ユニットに結合し、-80°Cで無期限に保管します。
  10. 凍結乾燥ペプチドを使用して、アセトニトリル、DMF、および分析グレードの水の混合物に1:1:1の1:1で1 mMのストック溶液を調製します。この溶液は、ペプチドが凝集しないため、少なくとも6ヶ月間保存できます。

2. 注射剤の調製

  1. 凍結乾燥ペプチドを希釈するために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.4)を調製します。
  2. ペプチドをPBSで最終濃度20μMまで溶解します。この溶液を新鮮に準備します。よく混ぜて、注入まで氷上で保存します。溶液内の凝集を防ぐために、30分を超えないようにしてください。

3. 麻酔

  1. 麻酔薬のストック溶液である 0.1% エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸 (MESAB) を、循環システムからの通常の魚水に調製します。麻酔液を最終濃度0.0025%(v / v)まで調製します。
  2. 必要な数の魚を水槽から取り出し、5Lのシステム水を入れた輸送容器に入れます。
  3. プラスチック製のペトリ皿(90mm)に40mLの麻酔薬を半分充填します。注射にはこの皿を使用してください。
  4. 手術の動きが止まるまで、魚を麻酔薬で孵化させます。

4. 脳室マイクロインジェクション

  1. 注射装置の調製
    1. ニードルプラーを使用して、加熱サイクル537、引っ張りサイクル250、速度1.5秒、時間80ミリ秒のパラメータでガラス注入キャピラリーを準備します。
    2. 圧力源の圧力設定を25psiにします。
    3. マイクロインジェクターのパラメーターを、ホールドの場合は 20 psi、イジェクトの場合は 10 psi、ピリオドの場合は 2.5、ゲートの場合は 100 ms に設定します。
    4. ガラスキャピラリーに注入液をロードします。ガラスキャピラリーをマイクロインジェクションホルダーに挿入します。射出角度を45°に調整します。
  2. 麻酔液で満たされた新しいシャーレに1匹の魚を入れます。
  3. 鉗子で魚を持ち、注射の向きを合わせます。
  4. 頭蓋骨の30Gの針の先端を使用して、2つの側板が交わる視蓋上にスリットを生成します。先端を脳組織に挿入しないでください、出血や損傷の原因になります。
  5. ガラスキャピラリーをスリットに挿入します。
    1. 針の先端のみを使用し、頭蓋骨から1mm以上貫通しないでください。魚を保持し続け、切開部位にガラス毛細血管の先端を挿入します。
    2. ガラスキャピラリーの先端を45°の角度で終脳に向けます。溶液1μLを注入します。注入後すぐに液が分散します。

5. リカバリー

  1. 魚が回復するまで、魚を輸送コンテナに戻します。コンテナを定期的に循環する魚の水に接続して、最適な水質を確保します。
    手記：通常、回復には 1 分かかります。それ以上時間がかかる場合、魚は麻酔薬に保持される時間が短くなければなりません(実験者はこれを最適化する必要があります)。

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結果

表1:Aβ42およびTR-Aβ42ペプチド配列。

ペプチドペプチド配列MW (グラム/モル)
Aβ42DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA4514.1
TR-Aβ42GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA5919.8

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Fmoc保護アミノ酸IRIS Biotech GmbH (ドイツ、マルクトレドヴィッツ)固相ペプチド合成(SPPS)のためのFmoc系アミノ酸
N、N、N'、N'-テトラメチル-O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)ウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)IRIS Biotech GmbH (ドイツ、マルクトレドヴィッツ)RL-1030活性 化
オキシマIRIS Biotech GmbH (ドイツ、マルクトレドヴィッツ)RL-1180ラセミ化抑制器
N,N-ジイソプロピルエチルアミンIRIS Biotech GmbH (ドイツ、マルクトレドヴィッツ)ソル-003基
ジメチルホルムアミドIRIS Biotech GmbH (ドイツ、マルクトレドヴィッツ)SOL-004溶媒
N-メチルモルホリンThermo Fisher (Kandel) GmbH, ドイツA12158(英語)基
1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC.(米国ミズーリ州セントルイス)157260 アルドリッチ活性 化
ピペリジンMERCK KGaA(ドイツ・ダルムシュタット)822299Fmocデプロクション試薬
ジクロルメタン(DCM)MERCK KGaA(ドイツ・ダルムシュタット)106050溶媒
ギ酸(FA)MERCK KGaA(ドイツ・ダルムシュタット)100264HPLC用バッファー部品
トリフルオロ酢酸(TFA)MERCK KGaA(ドイツ・ダルムシュタット)808260Clevage Mixture試薬
トリイソプロピルシラン(TIS)MERCK KGaA(ドイツ・ダルムシュタット)233781 アルドリッチClevage Mixture試薬
アセトニトリル(UPLC/LCMS用)シグマ・アルドリッチ・ラボケミカリエン社34967から1L溶媒
アセトニトリル(HPLC用)VWR International Ltd、イギリス83639.32溶媒
ジエチルエーテルVWR International Ltd、イギリス23811.326ペプチド沈殿用溶媒
ジチオトリトール(DTT)VWR International Ltd、イギリス0281-25グラムClevage Mixture試薬
TentaGel S RAM Fmoc リンク アミド樹脂Rapp Polymere GmbH(ドイツ、テュービンゲン)S30023SPPSの固相
ペプチド合成 5 ml シリンジ (フィルター付属Intavis AG (ドイツ、ケルン)34.274SPPS用および固相からの開裂用の反応チューブ
ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルターザルトリウス・ステッティム(フランス、オーバーニュ)11806-50-N沈殿ペプチドのろ過
ポリフッ化ビニリデン(PVDF)シリンジフィルターCarl Roth GmbH + Co. KG カールスルーエKC78.1HPLCのプレフィルタリング
ペプチドシンセサイザーIntavis、ケルン、ドイツレスペップSL全相ペプチド自動合成装置
ウォーターアライアンスHPLCウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国ウォーターズ 2998、ウォーターズ e2695半分取逆相高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)
PolymerX、ビーズサイズ10μm、250x10 mmPhenomenex Ltd.(ドイツ)00G - 4328 - N0多孔質ポリスチレンジビニルベンゼンHPLCカラム
Milli-Q Advantage A10、Milli-Q フィルター付きEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA (米国マサチューセッツ州ビレリカ)LCPAK0001浄水システム
ろ過ユニットザルトリウス・ステッティム(フランス、オーバーニュ)16307ペプチド沈殿用ろ過ユニット
UV 検出器を搭載した UPLC Aquityウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国M09UPA 664MLC-MS用の分析用逆相ウルトラHPLC
ACQUITY UPLC BEH C18、ビーズサイズ 1.7 μm、50 × 2.1 MMウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国186002350分析 C18 カラム
ACQUITY TQ 検出器ウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国QBB908エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + バキューブランド RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH、ドイツ16706、101542真空ポンプ付き凍結乾燥機
パラダイムプレートリーダーベックマン・コールター
MESAB(エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸)シグマ・アルドリッチA5040 (英語)
ペトリ皿ザルシュテット821.472
リン酸緩衝生理食塩水ライフテクノロジーズ、GIBCO〒10010-056
針ベクトン・ディキンソン305178
解剖顕微鏡オリンパス、ライカ、ツァイスメーカーにより異なる
デュモンピンセット世界の精密機器501985
鉗子を解剖するギリー世界の精密機器501265
ガラス注入キャピラリー世界の精密機器TWF10
ピコノズル世界の精密機器5430-12
空気圧PicoPump世界の精密機器SYS-PV820
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