アルツハイマー病モデルのためのアミロイドベータタンパク質の脳定位直接注入

要約

出典: Jean, Y. Y. et al., Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、アルツハイマー病のマウスモデルを確立するために、歯状回へのアミロイドベータの正確な定位固定装置注入を示しています。アミロイドβタンパク質の正確な座標決定と制御された送達は、ニューロンの分解を引き起こし、記憶処理を混乱させ、アルツハイマー病の発症に寄与します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術器具と手術用溶液の準備

1. すべてのステンレス製手術器具をオートクレーブします。
2. 200プルーフの無水エタノールを滅菌分子グレードの脱イオン蒸留水で希釈することにより、70%エタノールを調製します。
3. 29Gの針をハミルトンシリンジに取り付けます。ハミルトンのシリンジとニードルの内部を清掃し、ナノピュア水を1分間繰り返し吸い上げて排出します。この手順を70%エタノールで繰り返します。
   1. ハミルトンシリンジからプランジャーと針を取り外します。層流フードO/Nで部品を風乾します。
   2. 使用前に針とシリンジに紫外線を30分間照射してください。
4. 塩化ナトリウム(NaCl)を分子グレードの水に溶解して、最終重量体積比濃度0.9%まで生理食塩水を調製します。溶液を0.2μmのポアフィルターでろ過して滅菌します。

2. オリゴマーアミロイドβ (Aβ1-42) を調製

組
1. 換えヒトAβ1-42をジメチルスルホキシド(DMSO)にモノマー化し、Fa'などの論文に記載されているとおりに5 mMまで再懸濁します。
2. 手術前日に5 mM Aβ1-42を滅菌済み(1x)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で100 μMに希釈します。
3. トリチュレーションにより溶液をよく混合します。
4. Aβ1-42溶液を4°Cで12時間インキュベートします
   手記：DMSOをPBSで希釈する、またはスクランブル/リバースAβ1-42ペプチドなどの制御溶液は、Aβ1-42と同じ方法で調製する必要があります。

3. 射出座標を決定する

1. 成体マウスの脳アトラスを使用して、関心のある脳領域の正確な前後座標(AP)、内側外側(ML)、および背腹座標(DV)を決定します。
   手記：この手法を説明するために、ブレグマから次の座標を持つターゲットとして海馬の歯状回を選びました:AP、-2.00 mm;ML、±1.3 mm;DV、-2.2mm。AP 値の前にある負の符号は、ブレグマの 2.00 mm 後方にあることを示します。ML 値に先行する±記号は、中心から左右の方向を示します。最後に、DVに先行する負の符号は、DVが脳の表面から腹側に移動していることを示しています。

4. 脳定位固定装置フレームの設定

1. サージカルフェイスマスク、清潔な白衣、滅菌サージカルグローブを着用してください。
2. 脳定位固定装置とマウスアダプターを70%エタノールで拭き取ります。
3. 滅菌済みの外科用ドレープをカウンターに置きます。
4. マウスアダプター付きの定位固定装置を滅菌外科用ドレープの上に置きます。
5. マウスの加熱パッドを70%エタノールで拭きます。ヒーティングパッドを脳定位固定装置フレームベッドの上に置きます。汎用のラボラベルテープを使用して、マウスアダプターベッドの上に加熱パッドをテープで貼り付けます。
   1. メーカーの指示に従って、加熱パッドを温水再循環ポンプに取り付けます。
   2. 温水再循環ポンプをオンにし、温度を37°Cに設定し、その温度に達するまで待ちます。
6. 50 μl の Hamilton シリンジに 29 G の針を装着し、メーカーの指示に従って電動垂直注入シャフトにねじ込み、脳定位固定装置
フレームに取り付けます。
7. ビーズ滅菌器の電源を入れ、メーカーの設定温度に達するまで待ちます.
   手記：これは、動物間のステンレス製器具の滅菌に使用されます。滅菌には、器具がビーズに接触して20秒かかります。
8. ホットプレートの電源を入れ、42°Cに設定し、清潔な空のケージを上に置きます。
9. ハミルトンシリンジを定位固定装置フレームに固定した状態で、電動定位固定装置インジェクターを使用してAβ1-42溶液を吸い上げます.
   手記： 4 μlを超える溶液をシリンジに吸い込み、次に定位固定装置インジェクターを使用して注入量を設定します。インジェクターは製造元の指示に従って操作してください。

5. 動物の調理法

1. 体重計を使用してマウスの重量を決定します。
2. 腹腔内(IP)に注射することにより、100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンでケタミン/キシラジンカクテルでマウスを麻酔します。.つま先のつま先つまみ反射の喪失により、麻酔の深さを監視します。
3. マウスを鎮静させた後、バリカンを取り、頭を剃って頭蓋骨の上の皮膚を露出させます。
4. マウスを定位固定装置ベッドの上の加熱パッドの上に置きます。
5. へらを使って口を開け、切歯を歯のガードの中に入れます。マウスの顔にノーズピースを固定します。きつすぎないように、やさしく締めます。
6. 両側の耳のクロスバーを耳道に配置して、頭を固定します。各クロスバーを頭蓋骨に当たるまで動かし、ネジを回してロックします。
   1. 頭が固定されていることを確認するには、人差し指を使って頭をそっと押し下げます。ヘッドがしっかりと固定されていれば、押しても出たり動かなくなったりすることはありません。
7. アイクリームまたは点眼薬を目に一滴垂らして、目をしっとりと保ちます。外科的処置全体を通して目が湿っていることを確認してください。
8. 手術部位を消毒するには、滅菌綿棒を使用してベタジン溶液を頭蓋骨の上の皮膚に塗布し、続いて70%エタノールを塗布します。ベタジンと70%エタノールの洗浄を交互にさらに2回行います。

6. 手術と注入

1. メスを使って頭皮の正中線に2〜3mmの切開を行い、その後、まっすぐな細いハサミで切開線を1.0〜1.5cmに伸ばし、頭蓋骨の矢状縫合糸、ブレグマ、ラムダを露出させます。これは、定位固定座標の基準となる目印です。マイクロクランプを使用して皮膚を離します.
   手記：ブレグマとラムダの位置は、マウス脳地図帳「The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates」で説明されています。
2. 綿棒を取り、滅菌生理食塩水に浸し、頭蓋骨をきれいにするために使用します。次に、清潔で乾いた綿棒を使用して頭蓋骨を乾かします。
3. 滅菌済みの細いポイントペンを使用して、ブレグマにドットをマークします。定位固定装置マイクロマニピュレーターを使用して、針の先端がブレグマのドットにちょうど触れるようにハミルトンシリンジを配置します。
   1. DV座標を録画します。
   2. 頭蓋骨のAP軸が水平になっているかどうかを確認するには、ハミルトンシリンジを後方に動かして、針の先端がラムダポイントに触れるようにします。
   3. DVの位置を記録します。bregma と lambda の DV 座標が 0.5 mm.
      以内であることを確認してください。 手記：目標は、bregma と lambda の間の DV の違いを最小限に抑えることです。
4. マイクロマニピュレーターを使用して、ハミルトンシリンジの針先をブレグマドットに戻します。
5. 開始APの位置を記録します。
6. 開始AP座標から2.00mmを引いて、終了AP位置を計算します。
7. マイクロマニピュレーターを使用して、ハミルトンシリンジ針を最終的なAP座標に再配置します。
8. 現在の ML 座標を記録します。
9. 開始 ML 座標から 1.3 mm を加算または減算して、左右の終了 ML 座標を計算します。
10. マイクロマニピュレーターを使用して、ハミルトンシリンジの針を終了ML座標のいずれかに移動します。
    1. 針先を両端のML座標の頭蓋骨の表面に接触させ、DV座標を記録し、値が0.5mm以内であることを確認します
       注: 目標は、2 つの終了 ML 座標間の DV の差を最小化することです。
    2. 終了座標で針を頭蓋骨の0.5〜1cm上に引き上げます。滅菌された細いポイントペンを使用して、頭蓋骨の表面に点をマークします。頭蓋骨の反対側に対してこの手順を繰り返します。
11. ハミルトンのシリンジを邪魔にならないように振ります。
12. 0.8mmのドリルヘッドをドリルに取り付けます。ドリルを両手で持ち、安定性のためにテーブルの表面に肘を置き、ドリルヘッドを左または右のML座標のシャーピードットの少し上に配置します。ドリルを作動させ、ドリルの先端を頭蓋骨の表面に下げて、頭蓋骨に穴を開けます。反対側についてもこの手順を繰り返します.
    手記： 新しく導入された穴から出血が発生する場合があります。出血がある場合は、清潔な乾いた綿棒を使用して血液を軽くたたきます。
13. ハミルトンシリンジを、新しく導入したMLホールのいずれかの位置に戻します。ハミルトン針を頭蓋骨のすぐ後ろまで下げます。この時点で、脳に穴を開けないように注意してください。針が頭蓋骨を通過したことを確認するには、人差し指を取り、針を頭蓋骨にそっと押し付けて、針が穴から出ないようにします。
14. 開始DV座標を記録します。
15. 開始 DV 座標から 2.2 mm を差し引いて、終了 DV 座標を計算します。
16. 針を最後のDV座標まで下げます。
17. 脳定位固定装置用インジェクターポンプを作動させ、4 μlのAβ1-42を0.5 μl/minの速度で歯状回に送り込みます。
18. 注入が完了したら、注射部位からの溶液の逆流を最小限に抑えるために、針をさらに1分間所定の位置に留まらせます。
19. 針を脳の反対側に動かし、手順6.13〜6.18を繰り返します。

>7. 動物の除去と術後のケア

1. イヤーバーとフェイス/ノーズガードのネジを外します。マウスを装置から取り外します。
2. 学生用の標準パターン鉗子を使用して頭皮を引っ張り、縫合糸で傷口をシールします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミンHCl(100mg/ml)	ヘンリー・シャイン・メディカル	1049007	動物1kgあたり100mgのケタミン
キシラジン(20mg / ml)	ヘンリー・シャイン・メディカル	利用不可	動物1kgあたり10mgのキシラジン
Aβ1-42	デビッド・テプロウ/UCLA	利用不可	100 μM;このアミロイドは論文で使用されました
Aβ1-42	バッヘム	H-1368	Teplow labのアミロイドの代わりに使用できます
Aβ1-42	アメリカンペプチド	62勝0敗80分	Teplow labのアミロイドの代わりに使用できます
スクランブルAβ1-42	アメリカンペプチド	62勝0敗46分	Aβ1-42を比較するためのコントロールペプチドとして使用可能
ジェンティール ルーブリッシング アイジェル	ノバルティス	利用不可	手術中にマウスの目を湿らせておくため、地元の薬局で見つけることができます
リフレッシュオプティブ潤滑剤点眼薬	アラガン	利用不可	手術中にマウスの目を湿らせておくため、地元の薬局で見つけることができます。GenTealの代わりに使用できます
ベタジン	ストールティング	50998	除菌・消毒に
ラウンド/テーパードスパチュラ	VWRの	82027-490	動物の口を開くために
ブルドッグSerrefinesクランプ(顎の寸法9X1.6mm;長さ28mm)	ファインサイエンスツール	18050-28	随意;注射時に頭皮の皮膚を離すため
ストレートファインハサミ(刃先25mm;着丈11.5cm)	ファインサイエンスツール	14060-11	頭皮のカットに
#3メスのハンドル	ファインサイエンスツール	10003-12
#11サージカルブレード	ファインサイエンスツール	10011-00	頭皮切開に
学生用標準パターン鉗子(先端寸法2.5x1.5mm;着丈11.5cm)	ファインサイエンスツール	91100から12	縫合中に頭皮を閉じたままに
トリマーコンボキット	ケントサイエンティフィック	CL9990-1201	髪の毛を剃るのに
T /ポンプ温水リサーキュレーター	ケントサイエンティフィック	TP-700	手術中の動物の温暖化に
蘇生可能なウォーマイニングパッド(5 "x 10")	ケントサイエンティフィック	TPZ-0510FEAの	手術中に動物を温めるためにT/Pump温水リサーキュレーターに取り付けるため
コードレスマイクロドリル	ストールティング	58610	0.8mmの鋼バリを使用して頭蓋骨に穴を開けます
ラボ標準定位固定装置、マウスおよび新生児ラットアダプター付き	ストールティング	51615
Just for Mouse Stereotaxic Instrument (マウス脳定位固定装置のみ)	ストールティング	51730	Stoelting Cat. #51615の代わりに使用できます。
クインテッセンシャル定位固定装置インジェクター	ストールティング	53311
ドライガラスビーズ滅菌器	ストールティング	50287	ステンレス製器具の滅菌用
滅菌外科用ドレープ(18インチ x 26インチ)	ストールティング	50981
ハミルトン シリンジ 50 ml、モデル 705 RN SYR、NDL	ハミルトンカンパニー	〒7637-01	脳注射の場合、溶液ごとに異なる注射器を使用してください
29ゲージニードル、スモールハブRN NDL	ハミルトンカンパニー	7803-06	脳内注射用ハミルトンシリンジへの取り付けに
1 ml BDツベルクリンシリンジ	VWRの	BD309659	麻酔と生理食塩水の投与に
30ゲージニードル(0.5インチ)	VWRの	BD305106	麻酔と生理食塩水の投与に
ポータブル電子CSシリーズスケール(オーハウス)	VWRの	65500から202	麻酔線量を決定するための動物の体重測定用
ホットプレート(トッププレート寸法7.25x7.25インチ)	VWRの	47751から148	手術後の動物の温暖化に
ソフシルクシルク縫合糸C-1カッティング3/8、12 mm	コヴィディエン	S1173	クロージング傷口用
Vetbondティッシュ接着剤(3M)	サンタクルスバイオテクノロジー	SC-361931	オプション:創傷閉鎖を支援するため。縫合糸と一緒に使用します。
綿先端木製シャフト滅菌アプリケーター	フィッシャーサイエンティフィック	〒22-029-488	外科的創傷の洗浄と乾燥に
Fisherbrand Superfrost Plus 顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15	脳切片の収集に
VWRマイクロカバーガラス24 X 50 mm	VWRの	48393241	顕微鏡スライドの取り付け用
Thermo Scientific Nalgene シリンジフィルター 0.2 μm	フィッシャーサイエンティフィック	〒194-2520	生理食塩水の滅菌用
Viscot Medicalによる滅菌デュアルチップスキンマーカー	メドライン	VIS1422SRL91	頭蓋骨の座標をマーキングするため