初代胚性マウスドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン蓄積の研究

Abstract

出典:Er, S. et al., Studying Pre-formed Fibril Induced α-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons.J. Vis. Exp. (2020).

このビデオは、α-シヌクレインの既成線維で前処理された胚マウスドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン蓄積を定量化するプロセスを示しています。免疫蛍光法を用いて、α-シヌクレイン凝集体を含むドーパミンニューロンを固定、染色、定量する手順を概説しています。

Protocol

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 準備

1. 0.46% D-グルコース、1% L-グルタミン、1% N2、0.2% プリモシンを含むドーパミン ニューロン メディウム (DPM) を調製し、DMEM/F12 で完成させます。材料を混ぜた後、DPMをろ過します。DPMは4°Cで保存し、各アリコートを1回だけ温めます.
   手記：DPM には、ドーパミン ニューロンの α-シヌクレイン蓄積を減少させるため、グリア由来神経栄養因子 (GDNF) を含めるべきではありません。
2. 非常に疎水性の高いシリコン化ガラスピペットを調製することで、胚性ニューロンの初期処理における表面への付着と細胞の損失を最小限に抑えます。
   1. 蒸留水1Lに10mLのシリコン化液を加え、2Lの容器で攪拌して混合します。ガラスピペットをシリコン溶液に15分間浸しておきます。
   2. ピペットを蒸留水で3〜5回すすいでください。ピペットを室温(RT)で一晩乾燥させるか、100〜120°Cの加熱滅菌スペースで1〜2時間乾燥させて乾燥を早めます。
   3. 密封されたオートクレーブバッグで標準的なオートクレーブ滅菌により、ピペットを滅菌します。
3. ニューロンの播種に使用する96ウェルプレートの中央のウェルに60μLのPO溶液を添加することにより、底部が透明なポリ-L-オルニチン(PO)コーティング96ウェルプレートを調製し、エッジの影響を避けるためにプレートの端に少なくとも1行/列のウェルを残します。コーティングされたプレートを室温で4°Cまたは4時間で一晩保管します。
4. 細胞をプレーティングする前に、POを完全に吸引し、100 μLの1x Phosphate Buffer Saline(PBS)で細胞を3回洗浄します。ウェルから1x PBSを吸引し、プレートの蓋を開けたままにして完全に乾燥させます.
   手記：使用済みのPOを収集し、再利用のためにフィルタリングすることが可能です。これは、同じPOソリューションに対して2回繰り返すことができます。
5. 50 μLのDPMを以前にコーティングしたウェルに添加します。100 μLのプラスチック製チップでウェルからDPMを吸引し、同時に円を描くようにウェルの底を引っ掻いて、各ウェルの周囲でコーティングを除去します。POコーティングされた島は、井戸の中央に残ります。
6. 層流フードの下に、コーティングされた各アイランドの中央に10μLのDPMを追加して、マイクロアイランドを作成します。
   手記：DPMで覆われたマイクロアイランドを備えたプレートは、細胞の単離中に層流フードの下に1〜2時間保持できます。

2. E13.5マウス胚からの腹側中脳底の分離

>注:中脳床の解剖手順については、図1を参照してください。

1. 解剖する前に、10cmのシャーレにダルベッコのバッファーを入れ、氷の上に置いておきます。
2. 施設のガイドラインに従って、E13.5妊娠中の雌マウスを安楽死させます。マウスを仰向けに平らに置き、前部に70%エタノールをスプレーします。鉗子で子宮の上の皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで切開して子宮を露出させます。
3. 子宮を慎重に取り外し、氷の上で前に準備したペトリ皿に入れます。
4. RTの層流フードの下にある手術用ハサミを使用して、子宮から胚を慎重に取り出します。鉗子で胚からすべての胎盤残留物を取り除き、ダルベッコの緩衝液で満たされた新しい10cmのペトリ皿に入れます。
5. 解剖鉗子または針を使用して、図1Aの黒い矢印でマークされた場所から頭の後肢を切り取ります。カットピースを胚の残りの部分から取り除きます(図1B)。
6. カットピースの後部を観察者に向けて置き(図1C)、尾側から頭蓋に向かってゆっくりと切り開きます(図1D)。頭蓋開口部の0.5 mm下から、図1Eに示すように、2 mm²〜3 mm²の領域を切断します。.
7. 腹側中脳底(図1Fを参照)を空の1.5mL微量遠心チューブに集めます。.すべての中脳の床がそれに集まるまで、微量遠心チューブを氷の上に置いてください.
   手記：あるいは、すべての胚脳を解剖した後、1mLのマイクロピペットで中脳の床を採取することもできます。

>3. E13.5マウス胚からの初代中脳培養を96ウェルプレート形式で確立

1. 同じ1.5 mLチューブ内のすべての胚から中脳の床を採取した後、残留ダルベッコ緩衝液を取り出し、500 μLのCa²⁺、Mg²⁺フリーのハンク平衡塩溶液(HBSS)で組織片を3回洗浄します。
2. HBSSを取り外し、500μLの0.5%トリプシンをチューブに加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
3. インキュベーション中に、1.5 mLのウシ胎児血清(FBS)を37°Cで温め、30 μLのDNase IをFBSに加えて混合します。また、シリコン処理されたガラスピペットの先端をファイヤーポリッシュします。穴に鋭いエッジがなく、1 mLマイクロピペットチップとほぼ同じサイズであることを確認してください><。 注:別の方法として、低接着性の1 mLマイクロピペットチップをトリチュレーションに使用できます。しかし、シリコン処理されたガラスピペットが最良の結果をもたらすようです。
4. ステップ3.2のインキュベーションが終了したらすぐに、500 μLのFBS/DNaseミックスを部分的に消化した組織に加えます。ガラスピペットを使用して、FBS /トリプシン混合物の組織を粉砕します。.組織が解離して、かろうじて見える小さな粒子になるまで回転させます。トリチュレーション中の気泡は避けてください。
5. 残った粒子を重力によって微量遠心チューブの底に沈殿させます。沈殿物を底部でピペッティングせずに、上清を空の15 mL円錐形ポリプロピレンチューブに集めます。
6. ステップ 3.3 (98:2) の FBS/DNase I を 1,000 μL の HBSS で希釈し、FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) を得ます。ピペッティングで上下に動かして混合します。1,000 μLの新しい混合物を、微量遠心チューブ内の残りの粒子に加えます。再度三回し、手順3.5を繰り返します。
7. 前の手順をもう一度繰り返して、すべてのFBS/DNase-I/HBSSを使い切ります(49:1:50)。
8. すべての上清が15 mLチューブ内に集まったら(ステップ3.5、3.7、および3.8)、卓上遠心分離機を使用して上清(~3 mL)を100 x gで5分間スピンダウンします。
9. DPMの2 mLをチューブに加え、100 x gで5分間スピンダウンして細胞ペレットを洗浄し、上清を取り除き、ペレット化した細胞内の破片を最小限に抑えるために2回洗浄を繰り返します。
   注:培養ニューロンには、常に新鮮で温められたDPMを使用してください。洗浄ステップでは、DPMは新鮮である必要はありませんが、37°Cに予温する必要があります。
10. 細胞を新鮮で温かいDPMで希釈し、微量遠心チューブに移します。希釈のためのDPMの量は、組織解剖に使用される胚の数によって異なります。例えば、150μLのDPMを使用して、10個の胚から得られた細胞を希釈します。
11. DPM中の細胞10 μLを微量遠心チューブに移します。これらを0.4%トリパンブルーステイン10μLと混合します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、生きた細胞(つまり、トリパンブルー陰性)をカウントします.
    注:ウェルあたり30,000個の細胞をプレーティングに使用すると、ウェルあたり~1,000個のドーパミンニューロンが得られます。細胞密度が6μLあたり~30,000細胞を超える場合は、播種量が6μL以上になるように、播種前に細胞をDPMでさらに希釈します。
12. ウェルの底に触れずに、手順1.6で作成したマイクロアイランドからDPMを取り外します。
13. 各ウェルで再現性のある細胞密度を得るためには、ウェルに播種する前に、穏やかなピペッティングで細胞を混合します。1〜10 μLのマイクロピペットを使用して、ウェルの中央の元の各マイクロアイランドの位置に6 μLの細胞を追加します。
14. プレートの端にある空のウェルに150μLの水または1x PBSを入れて、ニューロン培養物を含むウェルからの蒸発を最小限に抑えます。プレートをインキュベーター内で37°C、5%CO₂で1時間インキュベー
トします。
15. 1時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を含む各ウェルに100 μLのDPMを加え、インキュベーターに戻します。
16. めっきの2日後(in vitro 2日目、またはDIV2)で、25 μLを取り出し、75 μLの新鮮なDPMを添加して、最終的な培地容量を150 μLにし、蒸発をできるだけ避けます。
17. DIV5で培地の半分を新しいDPMと交換します(つまり、75 μLを取り出し、75 μLの新鮮なDPMを追加します)。DIV5 以降は、メディアの変更を行わないでください。

>4. 予め形成された原線維の播種による初代胚性ドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン凝集体の誘導

α-synuclein-preformed fibrils(PFF)を使用した作業の後、層流フードまたはPFFに接触した可能性のある機器を1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で清掃し、次に70%エタノールで清掃します。

1. 実験に先立ち、PFFを1x PBSで最終濃度100 μg/mLまで希釈します。希釈したPFFをマイクロ遠心チューブ内の浴超音波処理器で高出力で超音波処理し、4°Cで10サイクル、30秒ON/30秒OFF.
   手記：フィブリルを適切に超音波処理して、~50 nmの長さのフラグメントを生成することが重要です。超音波処理されたPFFのサイズは、染色されたPFFの透過型電子顕微鏡画像から直接測定することができる。あるいは、チップソニケーターを使用することもできます。超音波処理されたPFFは、複数回の凍結/融解サイクルを避けるために、小さなアリコートで-80°Cで保存することができます。
2. DIV8では、ウェル内の150 μLの培地にウェルあたり3.75 μLの100 μg/mLのPFFを添加し、最終濃度を2.5 μg/mLにします。コントロールグループには同量の1x PBSを使用します。
3. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1x PBSに調製し、アリコートを-20°Cで保存します。これを行うには、以下の手順に従います。
   注:PFAは有毒です。準備中はマスクと手袋を着用し、常に層流フードの下で作業し、施設の指示に従ってすべての固体および液体のPFA廃棄物を処分してください。
   1. 1 Lの容器で500 mLの1x PBSを温めます。容器に攪拌棒を入れ、加熱機能付きのマグネチック攪拌機に容器を載せます。温度を40〜60°Cに調整して、溶液を暖かく保ちながら沸騰を防ぎます。
   2. ボンネットの下で20 gのPFA粉末を使い捨てのプラスチック測定容器で測定します。1x PBSで満たされた容器にPFA粉末を慎重に加えます。溶液の攪拌を開始します。
   3. 200 μL の 5 M 水酸化ナトリウムを溶液に加え、PFA が完全に溶解するまで ~15 分間撹拌を続けます。
   4. 溶液が均一に見えるようになったら、5 M塩化水素168 μLを加えて、pHを~7にバランスさせます。使い捨ての色固定pHインジケーターストリップでpHを確認してください。
   5. ヒーターから容器を取り出し、RTまで冷まします.溶液をろ過し、-20°Cで保存するために分注します。使用前にRTで分注を解凍し、その後再凍結しないでください。
4. DIV15では、ピペッティングしてウェルからすべての培地を取り出します。各ウェルに50 μLの4% PFAを加えて細胞を固定し、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルからPFAを取り出し、各ウェルに1x PBSを100 μL加えて細胞を洗浄します。1x PBSを取り外し、さらに2xを洗います。
5. 乾燥を避けるために、各ウェルに1x PBSを100 μL残します。免疫化学が実施されるまで、プレートを4°Cで保存します。

>5. 96ウェルプレートにおける初代胚性ドーパミンニューロンの免疫蛍光染色と自動イメージング

1. 1x PBSを除去し、ウェルあたり100 μLの0.2% Triton X-100をPBS(PBST)に添加し、室温で15分間インキュベートして細胞を透過処理します。
2. PBSTを取り外し、ウェルあたり50 μLの5%正常ウマ血清(NHS)をPBSTに加えます。非特異的抗原活性をブロックするには、室温で1時間インキュベートします。
3. チロシンヒドロキシラーゼ(TH)およびpS129-αsyn(1:2,000)に対する一次抗体をPBST中の5%NHSで希釈します。希釈した抗体50 μLを各ウェルに加え、4 °Cで一晩インキュベートします。
4. 抗体を取り出し、各ウェルに100 μLの1x PBSを加えて細胞を洗浄します。1x PBSを取り外し、2回洗浄を繰り返します。
5. 蛍光分子の漂白を防ぐために、最小限の光条件下で作業を開始してください。蛍光標識した二次抗体(1:400)をPBSTで希釈します。希釈した抗体50 μLを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベー
トします。
6. 抗体溶液を取り出し、各ウェルに100 μLの1x PBSを加えて細胞を洗浄します。1x PBSを取り外し、2回洗浄を繰り返します。
7. PBSを1倍取り出し、ウェルあたり200 ng/mLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を50 μL加えて培養細胞の核を染色し、室温で10分間インキュベー
トします。
8. 細胞を1x PBS100 μLで3回、それぞれ5分間洗浄します。最後の洗浄後、各ウェルに1x PBSを100 μL保持してください。プレートをアルミホイルで覆い、イメージングするまで4°Cで保存します。
9. 10倍対物レンズを取り付けたハイコンテントプレートスキャナー(材料表を参照)を備えた96ウェルビュープレートで初代胚性ドーパミンニューロンを画像化します。
10. プレートの種類、メーカー、サイズ、ウェル間の距離、培地の種類と量など、96ウェルプレートの仕様に基づいて設定を調整します。
11. マイクロアイランド内のすべての細胞をカバーするウェルのイメージング領域を選択します。オートフォーカスを調整するための例をよく選びます。最初の焦点は DAPI に基づきます。
12. コントロールウェルでの染色の強度に基づいて、各蛍光チャンネルの取得時間を校正します。PFF処理したコントロールウェルでは、細胞体内にpS129-αsyn凝集体を持つドーパミン細胞を明確に区別できるようにパラメータを調整し、pS129-αsyn陽性細胞とpS129-αsyn陰性細胞の明確な定量を可能にします
    手記：PFFを含まないウェルには、pS129-αsynの染色を施さないでください。したがって、これらのウェルは、pS129-αsyn強度を調整するためのネガティブコントロールとして使用できます。
13. 選択したすべてのウェルを10倍対物レンズで、すべてのチャンネルについて同時にイメージングし、まったく同じパラメーターで免疫蛍光染色を行います。
14. 必要に応じて、ウェルのサブセットのα-シヌクレイン封入体を糸状α-シヌクレインに特異的な抗体で標識し、pS129-αsyn陽性封入体の数の変化が、pS129-αsynのリン酸化または脱リン酸化の阻害ではなく、タンパク質蓄積の減少を反映していることを確認する。
15. ステップ5.3を繰り返し、pS129-αsyn抗体をα-シヌクレインフィラメント抗体(1:2,000)に置換します。ステップ5.13のように、染色された凝集α-シヌクレインを画像化します。

Results

図1:E13.5マウス胚から採取した中脳底の解剖 (A)頭部の後肢の切断位置は、黒の矢印と白の破線でマークされている。(B)ピースは胚の残りの部分から取り除かれました。取り外したピースは丸で囲まれています。(C)ピースを90°回転させて、観察者に対して後方を向かせました。(D)ピースは、尾側から頭蓋側(白い破線でマークされている)の黒い矢印から開かれました。(E)開口部の0.5mm〜1mm下から、^2mm2〜^4mm2の領域を切り取りました(黒線でマーク)。(F)腹側中脳床は孤立していた(黒い破線の四角でマークされている)。スケールバー= 1 mm。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% トリパンブルーステイン	Gibco、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	15250061
15 ml セルスターポリプロピレンチューブ	Greiner Bio-One GmbH、フリッケンハウゼン、ドイツ	188261
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	10236276001
5 M HCl	該当なし	該当なし	メディアキッチン、バイオテクノロジー研究所、ヘルシンキ大学
5 M NaOH	該当なし	該当なし	メディアキッチン、バイオテクノロジー研究所、ヘルシンキ大学
96ウェルViewPlate(ブラック)	パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	6005182
99.5%エタノール(EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, フィンランド	該当なし
AquaSil シリコン化液	Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム	情報発信元:TS-42799
オートクレーブ滅菌済み 1.5 ml 微量遠心チューブ	該当なし	該当なし	メディアキッチン、バイオテクノロジー研究所、ヘルシンキ大学
バイオラプター超音波処理装置	Diagenode、リエージュ、ベルギー	B01020001
Ca2+、Mg2+フリーハンク平衡塩溶液(HBSS)	Gibco、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	14175-053
CellProfilerおよびCellAnalystソフトウェアパッケージ	該当なし	該当なし	無料のオープンソースソフトウェア
遠心分離機 5702	Eppendorf AG、ハンブルク、ドイツ	5702000019
CO2インキュベーター	HeraCell、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	該当なし
計数室	BioRad Inc.、米国カリフォルニア州ヘラクレス	1450015
DeltaVision超高解像度顕微鏡(エアテーブルとキャビネット付き	GE Healthcare Life Sciences、米国マサチューセッツ州ボストン	29254706
デオキシリボヌクレアーゼ-I(Dnase I)	ロシュ、バーゼル、スイス	22098700
D-グルコース	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	G8769
DMEM/F12	Gibco、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	21331-020
ロバ用マウス対策 AlexaFluor 488	Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム	A21202の
ロバ駆ウサギ AlexaFluor 647	Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム	A31573 (英語)
ロバ反羊 AlexaFluor 488	Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム	A11015 (英語)
ダルベッコのバッファー	該当なし	該当なし	メディアキッチン、バイオテクノロジー研究所、ヘルシンキ大学
ウシ胎児血清(FBS)	Gibco、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	10500056
フィッシャーブランドプレーンエコノミーPTFEスターバー	fisher scientific、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ	11507582
ImageXpress Nano 自動イメージングシステム	Molecular Devices、サンノゼ、カリフォルニア、米国	該当なし
L-グルタミン	Gibco、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	25030-032
マウスモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ	ミリポア、メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ語	マブ318
N2サプリメント	Gibco、Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	17502-048
ノーマルホースセラム	Vector Laboratories Inc.、バーリンゲーム、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	S-2000
パラホルムアルデヒド(PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	158127
パラホルムアルデヒド粉末、95%	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	158127
pH-Fix、色固定インジケーターストリップ	Macherey-Nagel, デューレン, ドイツ	92110
ホスポエート緩衝生理食塩水(PBS)	該当なし	該当なし	メディアキッチン、バイオテクノロジー研究所、ヘルシンキ大学
ポリ-L-オルニチン	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	P4957
プリモシン	InvivoGen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国	ANT-PM-1、ANT-PM-2
ウサギモノクローナル抗α-シヌクレインフィラメント	Abcam, ケンブリッジ, イギリス	ab209538
ウサギモノクローナル抗リン-セリン129-α-シヌクレイン	Abcam, ケンブリッジ, イギリス	AB51253
RCTベーシック、IKAマグネティックスターラー	IKA-Werke® GmbH、シュタウフェン、ドイツ	3810000
組換えヒトグリア由来神経栄養因子(hGDNF)	PeproTech、ロッキーヒル、ニュージャージー州、米国またはプロスペック、ネスシオナ、イスラエル	450-10(ペプロテック)、CYT-305(プロスペック)
組換えマウスαシヌクレイン形成済み線維(PFF)	該当なし	該当なし	共同研究者であるKelvin C Luk教授からの寄贈
研究用実体顕微鏡システム	オリンパス株式会社(東京)	SZX10
ヒツジポリクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ	ミリポア、メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ語	AB1542
TC 20 自動セルカウンター	BioRad Inc.、米国カリフォルニア州ヘラクレス	1450102
トリトンX-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	11332481001
トリプシン	MP Biomedicals、Valiant Co.、煙台、山東省、中国	2199700