出典:Larpthaveesarp, A., et.alです。P10ラットにおける新生児脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル。J. Vis. Exp.(2017)
このビデオは、ラットの子犬における中大脳動脈閉塞モデルの確立を示しています。内頸動脈(ICA)が露出し、結紮糸が固定されて血液の洪水が抑制されます。閉塞はICAを介して挿入され、中大脳動脈に到達します。その後、子犬はさらなる分析の前に回復します。
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方法論記事
局所脳虚血を誘発するためのラットの子犬における中脳動脈閉塞の生成
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2025年4月28日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1.中大脳動脈閉塞
- 子犬の体重を測り、適切な体重(19-21g)であることを確認してください。100%酸素(O2)中の3%イソフルランで子犬を麻酔し、足の挟み込みに反応がないことを確認します。手術ステージの下に加熱パッドを使用して、体表面温度を35.5°Cから37°Cに維持します。
- 肩の部分をテープで仰臥位に固定します。滅菌綿棒を使用して、ポビドンヨード溶液で頸部前部を綿棒し、続いて二蒸留水に70%エタノールの綿棒を入れ、各溶液を交互に合計4本の綿棒で拭きます。
- 計画された切開部位に0.25%のブピバカインを局所的に浸潤させます。ステレオスコープを使用して、正中線を5〜7mmの前方頸部切開を行い、総頸動脈(CCA)を露出させます。空洞を開いたままにし、動脈を露出させるために、2〜4個のリトラクターを配置します。
- 内頸動脈(ICA)、後頭動脈(OA)、および外頸動脈(ECA)を特定します。動脈を手入れして、はっきりとした視界を確保します。迷走神経を乱さないように注意してください。
注:偽手術の子犬の場合、切開部は開いたままで、動脈が露出し、その後、切開部を縫合して閉じます。総麻酔時間は閉塞手術と同等です。 - 6-0の絹編み込み縫合糸を1.5cmカットします。縫合糸をほどき、一本鎖を引き抜きます。一本鎖がきれいで、ほつれていないことを確認してください。
注：必要であれば、一本鎖を滅菌水に浸し、鉗子の先端で鎖を手入れして、擦り切れた端を滑らか にしてください。 - 縫合糸を45度の鉗子で保持しながら、鉗子を弧を描くように動かしてICAの下をくぐり、鉗子の先端がICAとOAの間に現れるようにします。
注：解剖がうまくいけば、このステップは比較的簡単になります。ICAとOAが接触している場合は、鉗子を使用してICAを分離する際に動脈を破裂させないように注意してください。出血が発生した場合は、出血が止まるまで鉗子で動脈に圧力をかけます。滅菌綿棒で血液を吸収します。 - 鉗子が保持している縫合糸の端をつかみ、端がアクセスしやすいように引っ張ってください。ストランドを鉗子から離し、鉗子をICAの下から戻し、ステップ1.5(図1A)で動きを逆にします。
- 一時的な合字をICAの基部の周りに結び、CCAから分離する場所に最も近い場所に結び付けます。
注:結び目を外すために引っ張られるストランドの端が鉗子で簡単につかむのに十分な長さ(1mm以上、3mm未満)になるように結び目を結ぶことが重要です。また、結び目の反対側には引っ込めるための適切な量の縫合糸ストランドがあることを確認してください。 - ICAを慎重に横方向に引っ込め、クリップを使用してストランドを切開部の反対側の腋窩領域近くの余分な皮膚に固定します。次のステップに進む前に、この収縮するストランドが血流を止めるのに十分なほど張っていることを確認して、制御不能な出血のリスクを最小限に抑えます。動脈が平らで淡いことを観察します。
注：過度に引っ込めると、ICAが部分的または完全に破損する可能性があるため、過度に引っ込めないでください。収縮は、動脈切開を行う直前に、クリップの反対側のストランドを引っ張ることで調整できます。 - ステップ1.5のように、45°の鉗子を使用して別の編組されていない縫合糸をつかみ、ICAの下と周りでループさせます。このストランドをリトラクションストランドの横方向に配置します(図1B)。
注:この手順は、撤回する前に行うこともできます。引っ込みの質がわからない場合は、次のステップの前にこの結び目を非常に緩く結ぶことができます。 - 結ばれた結紮糸と結ばれていない結紮糸の中間で0.2mmの動脈切開術をカットし、結ばれた結紮糸に近づきます。
注:結ばれた動脈に残っている血液は、動脈切開によって空になることがありますが、5μLを超えてはなりません。出血が続く場合は、過度の緊張によって動脈が損傷しないように注意しながら、リトラクションストランドを慎重に引っ張ってリトラクションを増やします。 - メートル法の定規を使用して、閉塞する縫合糸を測定し、再灌流中に閉塞を取り除くために2-3mmの追加許容量で縫合糸を切断します。オクルーダーを45度の鉗子で保持し、まっすぐな鉗子を使用して、MCAに到達するための適切な長さで曲げを作成し、前進の停止点をマークします。
注:シリコン先端から曲げまでの10mmの咬合長は、この体重範囲の出生後またはP-10 Sprague DawleyまたはLong Evansラットの子犬に使用されます。 - 45°の鉗子を使用して、シリコーンコーティングされたナイロン閉塞縫合糸を動脈切開に送り込み、MCAまでの所定の距離を示す曲げまで縫合糸を進めます（図1C）。進行がスムーズに感じられるようにします。抵抗を感じた場合は、すぐに進行を停止してください。進行中は、縫合糸をCC/ECAと平行な方向、頭に向けます。
注：縫合糸が動物の背骨に向かって背側に進むと、翼状口蓋動脈(PTA)にぶつかる可能性があります。3〜5mmの前進後に抵抗が感じられる場合は、縫合糸がPTA接合部に当たっています。前進方向を調整する前に、シリコンヘッドが動脈切開術の近くに来るまでオクルーダーを動脈から戻します。開動脈から閉塞器を完全に取り外す必要はありません。 - ステップ1.10（図1D））のストランドを使用して一時的な結紮糸を結び、オクルーダーを保護します。
- リトラクタークリップを削除します。結び目を取り外すために引っ張られる結び目のストランドがまっすぐな鉗子でつかみやすく、結び目を締めるために引っ張られるストランドよりも長くなるように、両方の一時的な結紮糸のストランドをトリミングします。
注:ストランドは、閉じた後にキャビティ内で絡まないように十分に短くなければなりません。 - リトラクターを取り外し、6-0の編みこみシルクを使用して空洞を閉じ、3つから4つの中断された縫合糸を作成します。
- 子犬を麻酔から外し、室内の空気中の加熱パッドに置きます。子犬が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで子犬を監視し、完全に回復したことを確認してからダムに戻します。子犬が体表温度を35.5°Cから37°Cに維持していることを確認してください。
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結果
図1:tMCAO手術のライブ手術画像。(A)最初の縫合糸ストランドは、ステップ 1.6 で詳述されているように、ICA にループされます。(B)最初の一時的な結紮糸が結ばれ、ICA が引っ込められます。2 番目の縫合糸ストランドは、ステップ 1.9 で詳しく説明されているように、最初の縫合糸ストランドの外側で ICA の周りにループされます。(C)シリコンコーティングされた閉塞縫合糸は、ステップ1.12で詳述されているように、動脈切開部位に供給されます。(D)2番目の一時的な結紮糸は、ステップ1.14で詳述されているように、オクルーダーを所定の位置に固定するために結ばれています。スケールバー = 1 mm.
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材料
