アルツハイマー病マウス脳切片におけるメトキシX04標識アミロイドプラークの可視化とマッピング

要約

出典: Bisht, K., et.al.β-アミロイドプラークとのミクログリア相互作用を研究するための相関光顕微鏡と電子顕微鏡. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、アルツハイマー病マウスの脳におけるメトキシX04標識アミロイドプラークの可視化とマッピングを示しています。蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡を使用した切片により、アルツハイマー病の病理を研究するための解剖学的構造とプラークの正確な相関が可能になります。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.メトキシX04染色プラークの存在に関する切片スクリーニング

1. 定位マウス脳アトラスの助けを借りて、関心領域を含む脳切片、例えば、本例で使用されている海馬CA1を選択します。各切片を十分な凍結保護剤溶液を含む24ウェル培養プレート内のウェルに入れ、切片が乾燥するのを防ぎます。
2. 以下の手順で切片が乾燥しないように、各切片を連続して調べます:
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の液滴を顕微鏡スライドに添加し、その切片を液滴の上に置きます。
   2. 蛍光顕微鏡で切片を検査し、methoxy-X04標識Aβプラークを含む領域を特定します。
      注: methoxy-X04は、蛍光紫外線(UV)フィルター(励起340 - 380 nm)を使用して簡単に視覚化できます。
3. プラークの存在を組織切片の構造領域に直接関連付けるためには、各画像が両方のフィールドで同じ領域を示す必要があるため、顕微鏡ステージを動かさずに、明視野および蛍光モードで関心領域(ROI)の画像をキャプチャします。
4. 動物番号に従って撮影した画像を保存し、名前を付けます。また、撮影した写真のプレートとフィールド内のウェル番号も記録します。たとえば、例: 9978A1B;動物番号:9978;井戸番号:A1;フィールド:明るい。イメージングが完了したら、セクションを指定されたウェルに戻します。
   注: 最終的に、調査した各セクションについて、明視野とUVフィールドの2枚の写真が得られます。
5. 同じROIの2つの画像(1つは明視野、もう1つはUVフィールド)を画像Jで開き、MosaicJプラグインを使用して2つの画像のエッジを整列させ、整列して結合された画像をウェル番号に従って保存します。
6. 特定の動物の番号を含む別のフォルダに画像を保存します。画像を組み合わせて、組織切片のプラークを特定して位置を特定し、2つの異なるフィールド(明るいフィールドとUV)のセクション全体を完全に表示します。
7. スクリーニングプロセスが完了したら、免疫染色またはさらなる処理が行われるまで、検査した切片を凍結保護剤を含む24ウェル培養プレートに-20°Cで保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Methoxy-X04	Tocris Bioscience	4920	10 mg 基質/錠剤
顕微鏡スライド	Fisher Scientific	12-550-15
24-well 組織培養プレート	Fisher Scientific	353047
エチレングリコール	Fisher BioReagents	BP230-4
グリセロール	Fisher BioReagents	BP229-4