覚醒ラットの神経活動の精密マッピングのための傍細胞記録と染色

要約

出典:Moore, J. D., et al. 警戒心、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons.J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、拘束された覚醒状態のラットで並行細胞の記録と染色の方法を実演しています。この手順では、ニューロンからの信号を記録し、色素を注入して記録部位を正確に特定します。この技術により、神経活動を脳の解剖学的構造に正確にマッピングすることができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.神経ユニットの傍細胞モニタリング

1. 先端径が1μm未満の二酸化炭素レーザーマイクロピペットプーラー(材料セクションを参照)で石英キャピラリーチューブを引っ張ります(図2A)。
   注:加熱パラメータは特定の機器によって異なり、必要なネックの直径は対象の脳の構造によって異なります。ラット視床での記録の場合、マイクロピペットには5〜7mmの範囲のネックがあります。
2. 長い作動距離の対物レンズを備えた微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡の下でピペットを所定の位置に固定します。モデリング粘土を使用して、ピペットを顕微鏡のステージの所定の位置に保持します。
3. ガラスブロック(厚さ0.5〜1cm、ウルトラミクロトームナイフを作るのに便利なガラス片)をピペットチップでゆっくりと視野に入れます。ステージマイクロマニピュレーターを使用して、ピペットの先端をガラスにそっと触れ、ガラスを破損させます。ピペットチップの外径が1〜3μmになるまで、必要に応じて繰り返します(図2B、C)。これらのマイクロピペットのインピーダンスが約5〜15MΩであることを確認してください。
4. 細胞外生理食塩水(135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、5 mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸)、pH 7.2、NaOH含有)を調製し、2%(w/v)Chicago Sky Blueを添加します。ピペットの後端に、30 G以下の針のシリンジを使用して溶液を充填します。あるいは、シングルセル隣接細胞標識の場合は、シカゴスカイブルーの代わりに生理食塩水に2%(w / v)ニューロビオチンまたはビオチン化デキストランアミン(BDA-3000またはBDA-10000)を追加します。
5. 適切な実験治具 (図1)の硬質チューブの内側に、ネズミを布靴下の中に置きます。手術後72時間以上待ってから、動物をヘッドレストジグに乗せてください。気道の閉塞を避けるために、首ではなく胸骨上部の周りに引きひもを締めます。呼吸が苦しい、または妨げられているように見える場合は、巾着を緩めるか、後方に動かします。ラットが警戒しているときにこの手順を実行します。
6. ラットの頭部拘束プレートを治具の対応するピースに取り付けます。これを行うには、最初にヘッドレストプレートを所定の位置に固定し、次に4-40ネジを使用して固定します。頭に過度のトルクがかからないように、動物が落ち着くまで待つようにしてください。次に、ラットに埋め込まれている頭部拘束ボルトに8-32ナットを取り付けます。次に、ねじ山付きステンレス鋼ロッドをヘッドボルトにねじ込みます。ロッドを実験治具に固定し、所定の位置に締め付けられるようにします(図1)。
   注:動物をヘッドボルトとヘッドレストプレートで固定すると、装置の曲がりが最小限に抑えられ、記録の安定性が向上します。ほとんどの場合、動物が頭を拘束された最初の日から記録を開始できます。ただし、動物が過度にそわそわしたり、声を出したりする場合は、録音を開始する前に、1日間の頭部拘束慣れトレーニングを提供してください。この場合、動物をジグに15分間置いてから、ケージに戻します。この手順を翌日も繰り返して、プロトコルを続行します。
7. 記録チャンバーを開き、シリコンゲルを取り外します。開頭術で組織が再成長した場合は、細い鉗子を使用して組織を洗浄します。
8. ピペットを電動マイクロマニピュレーターに取り付け、ヘッドステージのプリアンプを差し込みます。
   注: このデモでは、ヘッドステージ上の小さなリレー回路が、アンプのリード線と外部電流源を高コンプライアンスで切り替えます (図 3A-C )。一部のアンプには、適切なハイコンプライアンスソースが組み込まれていることに注意してください。
9. 電動マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットの先端を記録チャンバー内の定位固定的に識別されたマークに移動します。この位置の座標に注意してください。頭蓋骨のピペットの先端を壊さないように注意してください。
10. ピペットを前後軸と中外側軸の目的の記録位置に移動します。次に、ピペットを硬膜を通って腹側に進め、目的の記録位置まで約500μm背側になります。
11. ピペットチップとリファレンスワイヤーの間に記録された増幅電圧のオーディオモニターでスパイクイベントを聞きながら、ピペットをゆっくりと進めます。スパイクイベントが特定されたら、約500 μVを超える正方向の電圧たわみが観察されるまで、ピペットを0〜100 μm動かし続けます。
    注:これが発生すると、電極抵抗は約1.5-10倍増加します。
12. 記録は、ユニットが分離されたら開始し、関心のある他のすべての行動的および生理学的測定とともに開始する必要があります。今回のデモでは、自己生成した振動の動きを高速ビデオ撮影でモニタリングします(Materials セクションを参照)。
13. 記録サイトにラベルを付けるには、電極リードを切り替えて電流源に接続します。これを行うには、リレー回路(Figure 3A-C)、アンプに内蔵された電流源、または手動(Figure 3D)を使用する方法がいくつかあります。-4 μAを2秒パルス、50%デューティサイクルで4分間通過させ、ピペットにChicago Sky Blueをイオン導入します。
14. 標準的な慣行に従って、いくつかのラベリング手順の後に動物を殺して灌流します。脳を切片化し、必要に応じて対比染色して、記録部位の解剖学的位置を特定します。組織を対比染色して、シトクロムオキシダーゼ反応性を確保します。あるいは、蛍光顕微鏡を使用してChicago Sky Blue鉱床を同定します。
    注: ラベルの異なる単位を正確に区別するには、ラベル間のピペットのクランプを解除せずに、すべてのラベルが同じ日に同じピペットで作成されることが重要です。この場合、記録部位は、ポストホック組織学における相対的な位置と、各部位の注目されるマニピュレータ座標によって区別できます。明確に識別するために、ラベルを互いに少なくとも200μm離し、脳領域ごとに3〜5個以下のラベルをマークします。

結果

図1:実験治具。電気生理学的および行動モニタリング実験用の機械式治具内のラットの図。治具はバーとプレート

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger工業供給	4KL86	20-40 cpシアノアクリレート
Vetbond	3M	1469SB
グリップセメント粉末	Dentsply Intl	675571	記録室のベース用
グリップセメント液体	Dentsply Intl	675572	録音チャンバーのベース用
シリコーンゲル	ウコーニング	Mar-80
ジェット義歯修理アクリルパウダー	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	頭部拘束装置を頭蓋に固定するため
オルソジェット 歯列矯正アクリル樹脂液	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	頭部拘束装置を頭蓋骨に固定するため
シカゴ・スカイブルー	シグマ	C8679
パラホルムアルデヒド	シグマ	158127	灌流・組織固定用
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ	P3813	灌流・組織固定用
シトクロムC	シグ	C2506
ジアミノベンジジン	シグマ	D5905
ラットソックス	、エレガント(カリフォルニア州サンディエゴ)	N / A
PVCチューブ2 1/2 "	米国プラスチック株式会社を	34108
サブミニチュア D ピン & ソケット	TE Connectivity	205089-1
ステンレス鋼の音楽線 直径 0.010"	Precision Brand Products, Inc.	21010
脳定位固定	Kopf Instruments	モデル 900
脳定位固定装置用イヤーバー	Kopf Instruments	モデル 957
脳定位固定装置マニピュレーター	Kopf Instruments	モデル 960
1/2 mm ドリルバー	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air 歯科用ドリル	中西部歯科	393-1600
ステンレス鋼 0-80 1/8" ネジ	ファスナー スーパーストア	247438
0.2mL 遠心分離管	フィッシャー サイエンティフィック	05-407-8A
カスタム ヘッド ホールディング バー	UCSD SIO マシン ショップ	N/A
直角ポストクランプ	ニューポート	MCA-1
8-32 3/4"ネジ	ファスナー スーパーストア	240181
4-40 1/4" ネジ	ファスナー スーパーストア	239958
石英キャピラリーチューブ	サッター機器	QF-100-60-10
電動マイクロマニピュレーター	サッター機器	MP-285
微小電極増幅器	分子デバイス	マルチクランプ 700B	代替部品:分子デバイス Axoclamp 900A
微小電極増幅器ヘッドステージ	Molecular Devices	CV-7B	代替部品:HS-9Ax10 分子デバイス Axoclamp 900A
分離パルス刺激装置	AMシステム	モデル2100	代替部品:HS-9Ax10 分子デバイス Axoclamp 900A
オーディオモニター	ラジオシャック	32-2040
電極リード線	クーナー線	NEF34-1646
アンプヘッドステージ用リレー	COTO Technology	#2342-05-000	(オプション) カスタムメイドのプリント回路基板を使用 (UCSD Physics Electronics Shop)、図 6A-C
デジタル ビデオ カメラ	Basler	A602fm
ピペットホルダー	Warner Instruments	#MEW-F10T
カスタムヘッドホールディングプレート	UCSD SIOマシンショップ	N / A

ダマ は縫う。装置用固定装置用固定装置フレーム