蛍光体の開発とイメージング技術、ウイルスはウイルスと細胞の間で早期に相互作用を視覚化するために考案されたデング熱ののAlexa Fluor ®標識の簡単な方法の進歩を活用して。
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この記事について
サマリー
要約
ウイルスと細胞の間の相互作用の初期段階でのイベントは、感染の結果に大きな影響を持つことができます。この相互作用に影響を与える要因を決定することは疾患の病因の理解の向上につながるため、ワクチンや治療薬の設計に影響を与える可能性がある。したがって、この相互作用を調べるための方法の開発は有用であろう。蛍光体の開発1-3とイメージング技術4の最近の進歩は、デング熱発症機序に関する現在の知識を向上させるため、毎年発生するデング熱感染数百万人を削減する道を開くために悪用される可能性があります。
包まれたデング熱ウイルスは、単一のプラス鎖RNAゲノム5を含むヌクレオカプシドシェルを、保護する90エンベロープ糖タンパク質（E）二量体で構成される外部足場を持っています。ウイルスの表面上に同一のタンパク質サブユニットは、このようにアミン反応性色素で標識し、免疫蛍光顕微鏡法によって可視化することができます。ここで、我々はAlexa Fluorスクシンイミジルエステル色素がラベルの後に非常に実行可能なウイルスをもたらした重炭酸ナトリウム緩衝液中で直接溶解でデング熱ウイルスの標識の簡単な方法を提示する。生きているウイルスやタンパク質標識は、通常、ジメチルスルホキシド中の染料の再構成を必要とするために、既存の製造業者のプロトコルのラベリングのための標準化された手順はありません。ジメチルスルホキシドの存在は、さらに微量で、ウイルスの増殖感染を遮断し、また細胞毒性6を誘発することができます。このプロトコルのジメチルスルホキシドの使用の排除は、このように、この可能性を減少させた。のAlexa Fluor ®色素は、優れた光安定性を持ち、細胞の取り込みとウイルスのエンドソーム輸送の研究に最適です、あまりpH感受性などフルオレセインやローダミン2のような一般的な染料、よりです。のAlexa Fluor ®色素のコンジュゲーションは、ウイルス特異的抗体と7宿主細胞内でのその推定受容体による標識デング熱ウイルスの認識に影響を与えなかった。このメソッドは、ウイルス学的研究に有用なアプリケーションを持つことができます。
プロトコル
1。デング熱ウイルスののAlexa Fluor ®標識
- ラベリング反応の前に、ショ糖クッションでデング熱ウイルスを精製し、プロトコルに示されるように必要な試薬や機器を準備する。
- ラベルとフィルタは0.2μmのシリンジフィルターで殺菌する直前に、新鮮な0.2M炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH 8.5（標識バッファー）、および1.5Mヒドロキシルアミン緩衝液、pH 8.3（試薬を停止する）準備。
- 2ミリリットルチューブ内のバッファを標識する1mlのデング熱ウイルスを精製したのは約3 × 10 8プラーク形成単位（pfu）を希釈する。これは、ウイルスのバッチの標識のために比例してスケールアップすることができます。
- 再構成する凍結乾燥のAlexa Fluor ® 594（AF594）標識反応直前にバッファのラベル付けさ1mmのスクシンイミジルエステル。のAlexa Fluor ®色素シリーズからの他の蛍光色素は、自分のニーズに応じて使用することができます。このステップ以降から光への曝露を最小限に抑えることができます。
- ピペットの先端で軽く攪拌しながら希釈したウイルスに1mMのAF594染料液100μlを追加。
- 暗所で1時間、室温で標識反応ミックスをインキュベートする。穏やかな逆転であらゆる15分を混ぜる。
- 卓上遠心機でチューブを軽くスピンし、ピペットの先端で軽く攪拌しながら反応混合物に停止試....
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ディスカッション
AF594染料がこのレポートで使用されていますが、のAlexa Fluorスクシンイミジルエステルシリーズの蛍光体の広い範囲で同様のラベリングの化学で使用可能です。これは、イメージングを超えてラベリングアプリケーションを拡張することができます。フローサイトメトリーは、FACSの機械によって励起して検出できる蛍光物質のラベリングの度合いを推定するための共焦点顕微鏡の代替として使用することができます。
のAlexa Fluor ®色素は遊離アミノ基、主にアルギニンとリシン9、通常は外側にタンパク質の残基が直面していると反応する小さな分子である。 Alexa Fluor 594の色素の100μMとデング熱ウイルスの研究室、共役してウイルス力価の損失を最小限に抑えて撮影するのに十分な明るさを提供する。異なる明るさは、使用する色素の濃度を変化させることによって達成することができる。しかし、染料濃度を増加させることは、ウイルスの生存率7,10を減らすことができます。一つの可能な制限は、フルオロフォアからのアクセスの遮断.......
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開示事項
我々は、開示に何もない。
謝辞
この作品は、国立医学研究評議会、シンガポールによって資金を供給されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（省略可能） |
| 重炭酸ナトリウム | シグマアルドリッチ | S6297 | |
| ヒドロキシルアミン | シグマアルドリッチ | 159417 | |
| 水酸化ナトリウム | メルク | 106498 | |
| AF594スクシンイミジルエステル | 分子プローブ、インビトロジェン | A20004 | |
| PD - 10カラム | GEヘルスケア | 17-0851-01 | |
| HEPES | シグマアルドリッチ | H6147 | |
| NaClの | シグマアルドリッチ | S3014 | |
| EDTA | シグマアルドリッチ | E9884 | |
| M - 199 | インビトロジェン | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4ウェルプレート | ヌンク | 176740 | |
| カバースリップ | Einst | 0111520 | |
| 顕微鏡のスライド | ブランドセイル | 7105 | |
| 3H5ハイブリドーマ | ATCC | HB46 | |
| 10倍PBS | 第一基地 | BUF - 2040 - 10X1L | |
| サポニン | シグマアルドリッチ | S4521 | |
| BSA | シグマアルドリッチ | A7906 | |
| マグネシウムの塩化 | シグマアルドリッチ | M2670 | |
| カルシウム塩化 | シグマアルドリッチ | C3306 | |
| Paraformaldehye | シグマアルドリッチ | 15,812-7 | |
| Mowiol 4から88 | カルビオケム | 475904 | |
| DABCO | シグマアルドリッチ | D27802 | |
| 卓上遠心機 | エッペンドルフ | 5424 | |
| 共焦点顕微鏡 | ツァイス | LSM 710 |
M - 199の増殖培地を準備するには、FBS、M - 199の500ミリリットルの非必須アミノ酸のピルビン酸ナトリウムと5ミリリットルの5ミリリットル、滅菌フィルター50mlのを追加します。
M - 199維持培地を準備するには、FBS、M - 199の500ミリリットルの非必須アミノ酸のピルビン酸ナトリウムと5ミリリットルの5ミリリットル、滅菌フィルターの15ミリリットル加える。
参考文献
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield excep....
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