外傷性脳損傷のマウスモデルにおける鼻腔内間葉系幹細胞送達

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 超常磁性酸化鉄(SPIO)ナノ粒子による間葉系幹細胞(MSC)の標識

1. MSCをSPIOで標識するには、6 mLの標識培地(ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中の25 μg/mLのSPIO)をMSCを含むT75フラスコ(80%コンフルエンシー)に加えます。
細胞
2. をCO₂インキュベーター(37°C、5%CO₂)で標識培地とともに振とうことなくインキュベートします。24時間後、真空に取り付けられたプラスチックチップを備えた滅菌パスツールピペットを使用して、ラベリングメディアをそっと取り除きます。細胞を6 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で単層2回洗浄し、微量の未内在化SPIOを除去します。
   1. 細胞が正常に標識されたかどうかを判断するには、SPIOが蛍光色素でタグ付けされているかどうかを蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で標識された細胞をチェックします(つまり、ここで使用されているもののように;図1B、C)。
3. 3 mLのトリプシンで処理して接着細胞を回収し、37°Cでインキュベートします。5分間のインキュベーション後、10%FBS(v / v)を含む7 mLの予熱したDMEM培地を加えて、トリプシンを不活性化します。ピペットを使用して細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに回収します。
4. 細胞懸濁液を300 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットをPBSに再懸濁します。トリパンブルー色素と血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。
   注:標識された細胞の細胞ペレットは、鉄の負荷により暗い色として表示されます(図1D)。このプロトコルは、MSC 標識および磁気共鳴画像法 (MRI) に関連しています。MSC標識の手順は以前に最適化されており、in vivo追跡が焦点であるため、ここではin vivoで追跡するために標識されたMSCを調製する手順のみが含まれています。他の細胞型の培養と標識のためのプロトコルは、研究者によって最適化されるべきです。
5. PBSを使用して細胞濃度を18 μLのPBS中の150,000細胞(または十分なMRI信号をもたらす数)に調整します(または鼻腔内送達手順で使用される総量)。
   注:150,000細胞/ 18μLのPBSを超える細胞濃度は、細胞凝集につながることが注目されました。 これは鼻腔内送達の効率に影響を与える可能性があります。鼻腔内投与は非侵襲的処置であり、複数回の投与が可能であるため、鼻腔内送達により多くの細胞数が必要な場合は、細胞懸濁液の総量を増やし、鼻腔内投与の回数を増

2.制御された皮質衝撃(CCI)損傷

注:このプロトコルでは、雄のC57 BL / 6マウス(7〜8週齢)を12/12時間の明暗サイクルで保ち、食物と水に自由にアクセスできました。

1. CCI損傷のために各マウスを準備するために、腹腔内(ip)注射(1 mL / kg)を介してゾラゼパム(50 mg / kg)およびキシラジン(20 mg / kg)麻酔カクテルを投与します。つま先を挟む反応がないため、麻酔の深さが十分であることを確認してください。または、マウスを2%〜4%イソフルランが供給されたチャンバーに60秒間置きます。
2. 電子バリカンを使用して、耳の間の頭蓋骨の背側表面の毛皮を剃ります。ヨウ素に浸した滅菌綿棒を使用して、剃った部分を数回掃除します。70%エタノールに浸した綿棒を使用して、ヨウ素を取り除きます。
3. 麻酔をかけたマウスを定位フレームに置き、イヤーバーとノーズバーを使用してマウスを固定します。滅菌ハサミを使用して剃った皮膚に正中矢状切開(約2.5cm)を行い、頭蓋骨の表面にアクセスします。
4. コットンパッドを使用して骨の組織を取り除き、頭蓋骨を露出させます。3%過酸化水素(H₂O₂)に浸した綿棒を使用して頭蓋骨の表面を10秒間洗浄し、乾いた綿パッドで洗浄します。
   注:頭蓋骨の縫合糸とブレグマとラムダの両方を簡単に識別できるようになりました。
5. CCI 損傷の頭蓋骨表面で選択した座標を特定し、鉛筆または適切なマーカーを使用して座標の周囲に円 (直径 4 mm) を描きます。
   注: このプロトコルでは、前後 (AP) -2.0 mm および中外側 (ML) +1.5 mm の座標が CCI 誘導に使用されました。
6. マイクロドリルと丸いバリ(直径0.5 mm)を使用して、マークされた円で頭蓋骨を薄くします。骨に穴を開けると脳実質に損傷を与える可能性があるため、穴あけ中に圧力を加えることは避けてください。清潔で乾いた綿棒を使用して骨粉を取り除きます。
7. 滅菌細い鉗子を使用して骨弁をそっと取り外し、硬膜を無傷に保ちながら露出させます。損傷前の準備に使用された定位フレームからマウスを取り外し、CCIデバイスの定位フレームに入れます。
8. イヤーバーとノーズバーを使用してマウスの頭を安定させます。マウスの頭が吻側から尾側方向に水平であることを確認し、必要に応じてノーズバーを調整します。
9. コントロールボックスの指示に従って、インパクターの先端を露出した皮質表面にゼロにします。インパクターのベースにあるXおよびYコントロールホイールを使用して、インパクターの先端が衝撃を受ける目的の皮質座標の真上に位置合わせされていることを確認してください。
コントロール
10. ボックスを使用して、速度5 m/s、滞留時間250 ms、損傷深さ1 mmで実験パラメータを設定し、マウスに軽度の損傷を誘発します。
11. コントロールボックスの「衝撃」ボタンを押して怪我を誘発します。滅菌綿棒を使用して出血を
拭きます。定位
12. フレームからマウスを取り外し、シルク外科用縫合糸を使用して切開部を閉じます。マウスはMRI用の磁場にさらされるため、手術部位を閉じるために金属製のクリップを使用しないでください。
13. 感染を防ぐために、局所抗生物質(バシトラシンネオマイシン)を手術部位に塗布します。マウスを加熱パッドの上に置き、回復段階ではマウスを注意深く監視します。
14. ケトプロフェンの投与が研究目標と矛盾しない限り、手術後 3 日間毎日ケトプロフェン (2.5 mg/kg、IP) を投与します。

3. 鼻腔内投与

1. CCI 導入後 1 日で、ゾラゼパム (50 mg/kg) とキシラジン (20 mg/kg) の麻酔カクテルを ip 注射で投与します。マウスがつま先をつまむ反応の欠如によって深く麻酔されていることを確認してください。
2. ヒアルロニダーゼ治療によるMSCの鼻腔内送達のためにマウスを準備します。
   1. マウスの首筋をつかみ、頭蓋骨を動けなくしながらしっかりと背中を向けます。ヒアルロニダーゼを含むピペットの先端を滅菌PBS(4 U / μL)にマウスの鼻孔近くに45°の角度で置きます。
   2. 各鼻孔に3μLのヒアルロニダーゼ懸濁液を投与します。マウスを固定し、清潔なパッド上で上を向いたままにして、5分間。ヒアルロニダーゼ治療を4回繰り返します(合計100Uヒアルロニダーゼ懸濁液)。
3. ヒアルロニダーゼ治療後、処理したマウスを清潔なパッドの上に上を向いて30分間保持します。
4. MSCを脳に送達するには、手順3.2.1で説明されているように、マウスをしっかりと保持します。3 μL/鼻孔のMSC懸濁液を3秒間隔で投与します。サンプル滴が完全に消えるまで、マウスを同じ位置に30秒間保持します。
   注:投与中に気泡を形成しないようにしてください。
最大
5. 3回まで2分間隔で投与を繰り返す。
   注:送達される細胞の総数は150,000であり、18 μLの細胞懸濁液を各鼻孔に対して3 μLの投与量でそれぞれ3回送達することができる。
6. マウスをケージに戻し、麻酔から完全に回復するまで注意深く監視します。

図1:MSCによるSPIO取り込みのプロトコルとin vitro確認の概略的なフローチャート。(A)MSCを標識のためにSPIOと24時間インキュベートしました。次に、標識されたMSCを鼻腔内(IN)経路を介してTBIマウスモデルに送達しました。標識されたMSCを追跡するために、異なる時点でMRIを実施しました。SPIOナノ粒子はFITCでタグ付けされていたため、SPIOによるMSCの十分な標識の確認は、FITCチャネルを使用した(B)蛍光顕微鏡および(C)共焦点顕微鏡によって達成されました。(D)標識されたMSCの細胞ペレットは、鉄負荷により色が濃く見えました。FITC = フルオレセインイソチオシアネート;SPIO =酸化鉄の超常磁性粒子;MSC = 間葉系幹細胞;MRI = 磁気共鳴画像法;IN =鼻腔内;外傷性脳損傷 = 外傷性脳損傷。