覚醒ラットにおける運動皮質の経頭蓋電気刺激

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.外科的処置:胸部電極移植

注:対電極をベストで剃った胸の外部に配置する場合は、このステップをスキップできます。

1. げっ歯類をうつ伏せ(胸に)手術台に置きます。
   注:吸入麻酔の場合は、ラットの鼻を麻酔ノズルに入れたままにし、イソフルラン濃度をさらに1.5〜2%に下げます。
2. 剃った頭皮を消毒スプレーまたは消毒剤(エタノール70%など)に浸した綿棒で消毒し、自然乾燥させます。2回繰り返します。
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3. スで皮膚を吻側の目の高さから中耳の高さまで一列に切ります。
   注:これにより、移植された胸部電極から頭のてっぺんに向かって接続ケーブルをトンネリングすることができ、直流刺激(DCS)電極ソケットの配置に必要なカットでもあります。
4. ラットを仰臥位に向け、胸が露出するようにします。
5. 手順1.2で説明したように、胸部の皮膚を消毒します。
6. 右胸の外側皮膚を組織鉗子で持ち上げ、右腋窩から内側に約0.5cmの小さなハサミでボタンホールを切ります。次に、はさみで頭蓋方向にまっすぐ矢状に切り込みます。
7. 左大胸筋から皮膚を非外傷的に切り離すことにより、皮下嚢を形成します。これを行うには、小さなハサミを繰り返し開きます(または生理食塩水を浸した綿棒で)。
8. 動物を右側に向け、開いた頭の皮膚の左後頭角から首に沿ってケーブル経路をトンネルし、恒常性鉗子を使用して表在筋膜を貫通して胸嚢に出ます。
9. 恒常性鉗子を慎重に開いて、鋭利なワイヤーが外れることなく、プラチナ電極に取り付けられた電極ケーブルの端をつかみます。電極がポーチに入るまで、はんだ付けポイントがげっ歯類の左後肢に向けられるまで、ケーブルをトンネルに通します。げっ歯類を腹臥位に戻します。
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10. チナプレートを滅菌合成編組の非吸収性縫合糸で胸筋膜の2つの反対側の角穴に固定します(安定性のために4〜5ノットをお勧めします)。
11. 同様に、ケーブルを緩い結び目で筋膜に取り付け、組織トンネルの入り口の前にわずかなループを形成します。
12. 切り口のサイズに応じて、3〜4本の皮膚縫合糸で皮膚を閉じます(電極とケーブルに同じ縫合糸材料を使用できます)。

2.外科的処置:頭蓋外経頭蓋電気脳刺激(tES)ソケットの配置

1. を定位フレームに入れます。
   注:吸入麻酔を使用する場合は、麻酔薬の濃度を~1.5〜1%の維持イソフルラン流量に下げ、つま先のつまみ反射と呼吸パターンに合わせて調整します。
2. 1.2の手順で説明したように、剃った頭皮を消毒します。
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3. スで皮膚を吻側の目の高さから中耳の高さまで一列に切ります。
   注:胸部電極の留置が実行された場合、手順2.2および2.3はすでに実行されています。
4. メスで骨膜(頭蓋骨の結合組織)を側面にこすり落とし、綿棒でよく拭き取ります。ブルドッグクランプで切り口の4つの角に結合組織を固定し、横方向にぶら下げて手術野を開いたままにします。
5. 0.9%生理食塩水を塗布して、綿棒で骨の表面と組織をきれいにします。次に、骨表面を3%H₂O₂で洗浄します。ティッシュとの接触を避けてください。これにより、骨がより徹底的に洗浄され、骨からの軽度の出血が止まります。また、骨膜の残余物が見えるようになります。綿棒で適度な圧力をかけてこれらの残留物を取り除きます。
   注:骨膜の残留物を除去すると、骨に接着されたtESソケットの接着性と耐久性が向上します。
   出血が
   1. 止まらない場合は、骨ドリルを使用し、骨にわずかな圧力をかけて1〜3秒間触れます。この機械的処置は、ほとんどの場合、大幅な加熱を行わずに出血を止めます。骨に電気焼灼は絶対に使用しないでください。短時間の適用でも脳組織の損傷を引き起こします(電気焼灼は創傷組織の出血にのみ使用する必要があります)。
6. 固定ネジを使用するとセットアップの密着性が向上するため、ネジのサイズに合ったドリルビットを選択してください。ハンドドリルで事前に穴を開けてから、骨ドリルでわずかな垂直圧力を加えて、2つの異なる骨プレートに2つのバリ穴を配置します。電極のねじ込みを妨げる可能性があるため、tES ソケットの希望の位置に近接することは避けてください (たとえば、左一次運動皮質 tES の場合は、右前頭頂および後頭頂スクリューの位置を選択します)。
7. 埋め込み型対電極の場合は、トンネルケーブルを将来固定するために、右後頭頂骨にある3番目の穴にバリを開けます。
8. プラスチック製のネジをバリ穴に置き、最初の摩擦が感じられるまでねじ込みます。次に、さらに3回180°のネジを回転させます。鉗子でネジの安定性を確認し、十分にきつくない場合はもう1回転追加します。
   注:成体ラットの場合、これにより、硬膜や脳を損傷することなくスクリューを硬膜外で配置できます(ネジ山の設計によっては、回転数が異なる場合があります)。DCS 電流密度が神経変性閾値を超えている場合でも、ステンレス鋼ネジの使用も実現可能であるはずです。スクリューの配置は、病変の位置やスクリューの下の範囲を乱さなかった。
9. はんだごての電源を入れ、約5分間予熱します。組織トンネルから出るケーブルを右頭頂スクリューの後頭に巻き付け、巻線の後ろに約1cmのケーブルを残して切断します。ケーブルの端にある絶縁体をメスで慎重に剥がします。
10. 巻いたケーブルをネジと骨にシアノアクリル接着剤で固定します。
11. 少量の鉛フリー錫はんだをコネクタと対極ケーブルの裸線に塗布し、錫はんだが溶けるまではんだ付け先端に触れながら、事前にはんだ付けされた両方の部品を短く押し付けて両方を接続します(約2〜3秒)。ケーブルの過度の金属加熱とその後の組織損傷を避けるために、はんだ付けチップをすぐに取り外してください。
12. 曲がった鋸歯状の先端鉗子でカスタムメイドのtES電極ソケット(図1B、赤)を持ち上げ、ソケットの下縁にシアノアクリル接着剤の薄い層を塗布します。運動皮質の上に配置し、直径 4 mm のソケットを使用する場合は、中央ソケット ポイントを前脳から 2 mm 前方、外側 2 mm に配置します。この位置では、ソケットの内側の内側の境界は矢状縫合糸で直接終了し、尾側の境界は前縫合糸の高さで終了する必要があります。ソケットを骨に短く押し付けます(ほとんどのシアノアクリル接着剤は圧力によって硬化します)。
    注:ソケットの真上に光源を配置すると、ソケットの配置が簡単になります。
13. ソケットの領域内の骨に接着剤が付着していないことを確認してください(接着剤は反射するため、光で確認します)。接着剤がこぼれた場合は、ソケットを取り外し、メスで接着剤をこすり、手順2.12を繰り返します。
14. ソケットが所定の位置にあり、将来の刺激領域に接着剤がなくなったら、まずソケットの外側の境界をシアノアクリル接着剤の少量の滴で隣接組織に密閉し、この場所での電流のシャントにつながる可能性のある流体ブリッジを回避します。接着剤が刺激領域に流れ込む可能性があるため、接着剤を塗布しすぎないでください(これが発生した場合は、ステップ2.12に戻ります)。
    注: 刺激領域を減らすと電流密度(A /m²)が劇的に増加する可能性があるため、刺激領域に接着剤が付着していない状態に保つことが重要です。
15. すべてのネジをシアノアクリル接着剤で覆います。
16. 2液型歯科用アクリルセメントを小さなシリコンチューブまたはガラスに混ぜます。粘性になったらすぐに歯科用ヘラで塗布し、ソケットの残りの境界を骨に密閉します。歯科用アクリルセメントが刺激領域に流れ込まないようにしてください。
17. 最後に、頭蓋骨全体、ネジ、対電極ケーブル、およびソケットの1/3までのソケットを歯科用アクリルセメントで覆います。セメントの粘度が正しいことを確認してください:液体が多すぎると、周囲の組織に流れ込みます。硬すぎると均等に分散するのが難しい。
18. すべての骨が覆われ、セメントが固まったら、ブルドッグクランプを取り外します。皮膚は、縫合を必要としないように、蓄積されたセメントに触れるだけで済みます。(最初のカットが長すぎて、結合組織または筋肉が見える場合は、ステップ1.12で説明されているように縫合糸を適用します)。
19. 切断した皮膚の境界の周りに綿棒でヨウ素を1層塗布し、カルプロフェンを皮下注射します(痛みの治療と輸液の補充のために5〜7.5 mLの0.9%生理食塩水に5 mg / kg体重を溶解)。
    注:吸入麻酔を使用する場合は、今すぐオフにしてください。
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20. っ歯類が目覚め、姿勢の安定性が回復するまで、麻酔から回復するためにげっ歯類を加温ボックスに入れます。
    注: 施設の推奨に従って、動物の体重の発達、傷の状態、および一般的な健康基準を毎日確認してください。

3.経頭蓋電気刺激手順

注:麻酔はtES効果に影響を与えるため、可能な限り警戒するげっ歯類に刺激を実行することをお勧めします。実験を開始する前に、げっ歯類が少なくとも5日間回復する(頭と胸の傷の治癒)の間、げっ歯類を待ちます。胸部の傷が最もイライラするため、ベストで固定された外部対電極を使用すると、手術後の早い時点で実験を行うことができますが、動物は数日間電極ベストに慣れる必要があり、行動タスクへの干渉が発生する可能性があります。

1. tES 電極ソケットの半分に 0.9% 生理食塩水を入れ、気泡を取り除きます。
2. 陰極経頭蓋直流刺激(tDCS)セッションの前に、常に塩素処理を確認し、必要に応じて(光沢のある銀の表面など)、Ag/AgCl電極を再塩素化します。陽極tDCSセッションの前に、以前の刺激から余分なAgCl沈着物をサンドペーパーで除去し、刺激中の良好な導電性を確保します。tES電極スクリューキャップをねじ込みます(図1B、灰色の部分)。
   注意:陰極tDCSセッションの間に電極を再塩素化しないと、刺激中の塩素化が枯渇し、電気化学反応によって有毒物質が蓄積します。これは組織の損傷を誘発します。刺激時間が 20 分未満の場合、1 回のセッション内で再塩素処理は必要ありません。
3. ケーブルをヘッドの2つのコネクタに接続します(陽極刺激の場合、陽極ケーブルはスクリューキャップのコネクタに接続され、陰極刺激の場合はその逆です)。
   注:外部に配置された対電極を使用する場合は、対電極を導電性ゲルで覆い、げっ歯類の胸に置きます。これは、電極が刺激中にげっ歯類が着用できる小さなげっ歯類のベストに事前に固定されている場合に最も簡単です。
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4. っ歯類を実験用ケージに入れ、ケーブルをケージの上のスイベルに接続して自由に動くことができます。
5. 刺激装置の電源を入れ、刺激パラメータ(刺激強度、持続時間、ランプアップおよびダウン時間)を調整します。
6. 安全シャットダウンおよび切断アラームを備えた市販の刺激装置を使用しない場合は、回路にメーターを含めて定電流の流れをチェックしてください。
   注: このセットアップでは、行動タスクの実行またはトレーニング中に刺激を適用できます。
7. 刺激中のげっ歯類にストレスや不快感の兆候がないか確認してください。
8. 刺激が終了したら、ケーブルを外し、ヘッドの電極キャップを緩め、綿棒でソケットを清掃して乾かします。げっ歯類を家庭環境に戻すか、必要に応じて行動手順を続行します。

図1:tESソケットと電極キャップユニットの手術および技術スキームのための消耗品。 (A) 1.綿棒、2。消毒剤、3。定位フレーム、4。はんだごて、5。鎮痛剤(カルプロフェンなど)、6。& 7.麻酔薬(キシラジンやケタミンなど)、8。注射器、9。クリッパー、10。イヤーパンチャー、11。眼軟膏(ベパンテンなど)、12。鉛フリー錫はんだ、13。2液型歯科用アクリルセメント(DAC)、14。ヨウ素、15。3%H2O2、16。生理食塩水0.9%、17.合成編組非吸収性縫合糸(例:メルシレン4-0)、18。ドリルビット、19。シアノアクリル接着剤、20。ブルドッグクランプ21。恒常性鉗子、22。曲がった鋸歯状の先端鉗子、23。まっすぐで鋭い先端鉗子、24。ストレート、組織鉗子、25。歯科用ヘラ、26。メス、27。はさみ、28。ハンドドリル、29。ドライバー、30。モーター駆動ドリル、31。メスコネクタ、32。tESソケット、33。ケーブルに取り付けられた正方形の白金電極、ヒストアクリル接着剤で覆われたはんだ付け接合部、34。プラスチックネジ。(B)内径4mmのげっ歯類の頭蓋骨に固定するためのtESソケット(赤)。電極ユニット(グレー)は、スクリューキャップと、スタンプの底に接着されたAg/Clディスク電極のケーブル用のスペースを残した中央の穴のあるインナースタンプで構成されています。これにより、セットアップの安定性を最大限に高め、敏感なワイヤ電極接続ポイントでのワイヤ断線を回避できます。